Imagerie à super-résolution de protéines sécrétées par des bactéries à l’aide de l’expansion du code génétique

Summary

Cet article fournit un protocole simple et clair pour marquer les effecteurs sécrétés par Salmonella en utilisant le site d’expansion du code génétique (ECG) et imager la localisation subcellulaire des protéines sécrétées dans les cellules HeLa à l’aide de la microscopie de reconstruction optique stochastique directe (dSTORM)

Abstract

Les systèmes de sécrétion de type trois (T3SS) permettent aux bactéries à Gram négatif d’injecter une batterie de protéines effectrices directement dans le cytosol des cellules hôtes eucaryotes. À l’entrée, les protéines effectrices injectées modulent de manière coopérative les voies de signalisation eucaryotes et reprogramment les fonctions cellulaires, permettant l’entrée et la survie des bactéries. La surveillance et la localisation de ces protéines effectrices sécrétées dans le contexte des infections fournissent une empreinte pour définir l’interface dynamique des interactions hôte-pathogène. Cependant, le marquage et l’imagerie des protéines bactériennes dans les cellules hôtes sans perturber leur structure / fonction est techniquement difficile.

La construction de protéines de fusion fluorescentes ne résout pas ce problème, car les protéines de fusion bloquent l’appareil sécrétoire et ne sont donc pas sécrétées. Pour surmonter ces obstacles, nous avons récemment utilisé une méthode de marquage fluorescent spécifique au site des effecteurs sécrétés bactériens, ainsi que d’autres protéines difficiles à étiqueter, en utilisant l’expansion du code génétique (ECG). Cet article fournit un protocole complet étape par étape pour marquer les effecteurs sécrétés par Salmonella à l’aide du site GCE, suivi de directives pour l’imagerie de la localisation subcellulaire des protéines sécrétées dans les cellules HeLa à l’aide de la microscopie de reconstruction optique stochastique directe (dSTORM)

Des découvertes récentes suggèrent que l’incorporation d’acides aminés non canoniques (ncAA) via GCE, suivie d’un marquage bio-orthogonal avec des colorants contenant de la tétrazine, est une technique viable pour le marquage sélectif et la visualisation des protéines sécrétées bactériennes et l’analyse ultérieure de l’image chez l’hôte. L’objectif de cet article est de fournir un protocole simple et clair qui peut être utilisé par les chercheurs intéressés à effectuer une imagerie à super-résolution en utilisant GCE pour étudier divers processus biologiques dans les bactéries et les virus, ainsi que les interactions hôte-pathogène.

Introduction

Les infections bactériennes ont longtemps été considérées comme un danger grave pour la santé humaine. Les agents pathogènes utilisent des systèmes de défense très évolués, extrêmement puissants et complexes, ainsi qu’une variété de facteurs de virulence bactérienne (appelés protéines effectrices) pour échapper aux réponses immunitaires de l’hôte et établir des infections ^1,2. Cependant, les mécanismes moléculaires sous-jacents à ces systèmes et le rôle des protéines effectrices individuelles sont encore largement inconnus en raison du manque d’approches appropriées pour suivre directement les composants protéiques cruciaux et les effecteurs dans les cellules hôtes pendant la pathogenèse.

Un exemple typique est Salmonella enterica sérovar Typhimurium, qui provoque une gastro-entérite aiguë. Salmonelle Typhimurium utilise des systèmes de sécrétion de type trois (T3SS) pour injecter une variété de protéines effectrices directement dans les cellules hôtes. Dès que Salmonella pénètre dans la cellule hôte, elle réside dans un compartiment membranaire acide, appelé vacuole contenant Salmonella (SCV)^3,4. Le pH acide du SCV active le T3SS codé par l’îlot de pathogénicité 2 de Salmonella (SPI-2) et transloque une volée de 20 protéines effectrices ou plus à travers la membrane vacuolaire dans le cytosol^{hôte 5,6,7,8}. À l’intérieur de l’hôte, ces cocktails complexes de protéines effectrices manipulent de manière coordonnée les voies de signalisation de la cellule hôte, ce qui entraîne la formation de structures membranaires tubulaires complexes et hautement dynamiques étendues à partir du SCV le long de microtubules, appelées filaments induits par Salmonella (SIF), qui permettent à Salmonella de survivre et de se répliquer dans les cellules hôtes^9,10,11.

Les méthodes permettant de visualiser, de suivre et de surveiller les localisations des effecteurs bactériens, et d’examiner leur trafic et leurs interactions à l’intérieur des cellules hôtes, fournissent un aperçu essentiel des mécanismes qui sous-tendent la pathogenèse bactérienne. Le marquage et la localisation des protéines effectrices T3SS sécrétées par Salmonella à l’intérieur des cellules hôtes se sont avérés être un défi technologique^12,13; Néanmoins, le développement de protéines fluorescentes codées génétiquement a transformé notre capacité à étudier et à visualiser les protéines dans les systèmes vivants. Cependant, la taille des protéines fluorescentes (~25-30 kDa)15 est souvent comparable ou même supérieure à celle de la protéine d’intérêt (POI; par exemple, ^13,65 kDa pour SsaP, 37,4 kDa pour SifA). En fait, le marquage des protéines fluorescentes des effecteurs bloque souvent la sécrétion de l’effecteur marqué et bloque le T3SS¹⁴.

De plus, les protéines fluorescentes sont moins stables et émettent un faible nombre de photons avant photoblanchiment, ce qui limite leur utilisation dans les techniques microscopiques à super-résolution^16,17,18, en particulier en microscopie de localisation par photoactivation (PALM), STORM et en microscopie à déplétion par émission stimulée (STED). Bien que les propriétés photophysiques des colorants fluorescents organiques soient supérieures à celles des protéines fluorescentes, des méthodes et techniques telles que CLIP/SNAP^19,20, Split-GFP 21, ReAsH/FlAsH 22,23 et HA-Tags ^24,25 nécessitent un appendice protéique ou peptidique supplémentaire qui peut altérer la structure-fonction de la protéine effectrice d’intérêt en interférant avec la modification ou le trafic post-traductionnel. Une méthode alternative qui minimise la modification nécessaire des protéines implique l’incorporation de ncAA dans un POI pendant la traduction par GCE. Les ncAA sont fluorescents ou peuvent être rendus fluorescents via la chimie de clic 12,13,26,27,28.

En utilisant l’ECG, les ncAA avec de minuscules groupes bio-orthogonaux fonctionnels (tels qu’un groupe azoture, cyclopropène ou cyclooctyne) peuvent être introduits à presque n’importe quel endroit d’une protéine cible. Dans cette stratégie, un codon natif est échangé avec un codon rare tel qu’un codon stop ambre (TAG) à une position spécifiée dans le gène du POI. La protéine modifiée est ensuite exprimée dans les cellules aux côtés d’une paire orthogonale aminoacyl-ARNt synthétase/ARNt. Le site actif de l’ARNt synthétase est conçu pour recevoir un seul ncAA particulier, qui est ensuite attaché de manière covalente à l’extrémité 3′ de l’ARNt qui reconnaît le codon ambre. Le ncAA est simplement introduit dans le milieu de croissance, mais il doit être absorbé par la cellule et atteindre le cytosol où l’aminoacyl-ARNt synthétase (aaRS) peut le lier à l’ARNt orthogonal; il est ensuite incorporé dans la POI à l’emplacement spécifié (voir la figure 1)¹². Ainsi, la CME permet l’incorporation spécifique au site d’une pléthore de groupes réactifs bio-orthogonaux tels que la cétone, l’azoye, l’alcyne, le cyclooctyne, le transcyclooctène, la tétrazine, le norbonène, le α, l’amide β-insaturé et le bicyclo [6.1.0]-nonyne dans un POI, surmontant potentiellement les limites des méthodes conventionnelles de marquage des protéines 12,26,27,28.

Les tendances émergentes récentes dans les techniques d’imagerie à super-résolution ont ouvert de nouvelles voies pour étudier les structures biologiques au niveau moléculaire. En particulier, STORM, une technique de super-résolution basée sur la localisation et basée sur la localisation, est devenue un outil inestimable pour visualiser les structures cellulaires jusqu’à ~20-30 nm et est capable d’étudier les processus biologiques une molécule à la fois, découvrant ainsi les rôles de molécules intracellulaires qui sont encore inconnus dans les études traditionnelles de moyenne d’ensemble¹³ . Les techniques monomoléculaires et de super-résolution nécessitent une petite étiquette avec des fluorophores organiques brillants et photostables pour la meilleure résolution. Nous avons récemment démontré que GCE peut être utilisé pour incorporer des sondes appropriées pour l’imagerie à super-résolution¹².

Deux des meilleurs choix pour le marquage des protéines dans les cellules sont la bicyclo [6.1.0] nonynelysine (BCN) et la transcyclooctène-lysine (TCO; illustrée à la figure 1), qui peuvent être génétiquement codées en utilisant une variante de la paire ARNt / synthétase (ici appelée ARNt Pyl / PylRS AF^), où^Pyl représente la pyrrolysine, et AF représente un double mutant rationnellement conçu (Y306A, Y384F) dérivé de Methanosarcina mazei qui code naturellement pour la pyrrolysine^12, 29,30,31. Grâce à la réaction de cycloaddition Diels-Alder (Siels-Alder) à demande inverse d’électrons favorisée par la déformation, ces acides aminés réagissent chimiosélectivement avec les conjugués de tétrazine (Figure 1)12,30,31. De telles réactions de cycloaddition sont exceptionnellement rapides et compatibles avec les cellules vivantes; Ils peuvent également être fluorogéniques, si un fluorophore approprié est fonctionnalisé avec la fraction tétrazine^12,26,32. Cet article présente un protocole optimisé pour surveiller la dynamique des effecteurs bactériens délivrés dans les cellules hôtes à l’aide de la CME, suivi de la localisation subcellulaire des protéines sécrétées dans les cellules HeLa à l’aide de dSTORM. Les résultats indiquent que l’incorporation d’un ncAA via GCE, suivie d’une réaction de clic avec des colorants fluorogéniques contenant de la tétrazine, représente une méthode polyvalente pour le marquage sélectif, la visualisation des protéines sécrétées et la localisation sous-cellulaire ultérieure dans l’hôte. Cependant, tous les composants et procédures détaillés ici peuvent être ajustés ou remplacés afin que le système GCE puisse être adapté pour étudier d’autres questions biologiques.

Protocol

1. Construction plasmidique Cloner le gène exprimant le POI dans un plasmide d’expression (p. ex. pET28a-sseJ 10TAG) qui exprime le POI dans E. coli BL21 (DE3). Cette étape facilite la détermination que les mutants sont fonctionnels. Pour la visualisation des effecteurs sécrétés par Salmonella dans les cellules hôtes, construire un plasmide d’expression (pWSK29-sseJ-HA) qui exprime le POI cible SseJ sous le contrôle de son promoteur nati…

Representative Results

Ce document de protocole décrit une méthode basée sur l’ECG pour le marquage fluorescent spécifique au site et la visualisation des effecteurs sécrétés par Salmonella, comme illustré à la figure 1. La structure chimique du groupe bioorthogonal transcyclooctène (TCO) ncAA et du colorant fluorescent est illustrée à la figure 1A. Le marquage SseJ a été réalisé par incorporation génétique de ncAA bioortho…

Discussion

L’approche décrite ici a été utilisée pour suivre l’emplacement précis des protéines effectrices injectées dans la cellule hôte par la bactérie T3SS après l’infection. Les T3SS sont utilisés par des agents pathogènes intracellulaires tels que Salmonella, Shigella et Yersinia pour transporter les composants de virulence dans l’hôte. Le développement de technologies d’imagerie à super-résolution a permis de visualiser les facteurs de virulence à une résolution jusque-l…

Materials

10x Tris/Glycine SDS running buffer	BIO-RAD	1610732
Ammonium chloride	Fischer Scientific	A661-500
Ammonium sulphate	Fischer Scientific	BP212R-1
Ampicillin Sodium	Sigma-Aldrich	A0166	5 g
Antibiotic-Antimycotic (100x)	ThermiFischer Scientific	15240096
Arabinose	Sigma-Aldrich	A3256	500 g
Avanti J-26XP (High-Performance Centrifuge)	Beckman Coulter
Bacto-Agar	BD Diagnostics, Franklin Lakes, USA	214010
BDP-FL-tetrazine	Lumiprobe (USA)	2.14E+02
β-mercaptoethanol	Millipore	444203	250 mL
Bromophenol blue	Sigma-Aldrich	B8026
BSA	Sigma-Aldrich	A4503	500 g
Casein	Sigma-Aldrich	C8654
Catalase	Sigma-Aldrich	C9322
Chloramphenicol	Sigma-Aldrich	C1919
Click Amino Acid / trans-Cyclooct-2-en – L – Lysine (TCO*A)	SiChem GmbH	SC-8008	Size: 500 mg
DAPI (Hoechst33342)	Invitrogen	H3570
DeNovix DS-11+ Spectrophotometer	DeNovix
DMEM*	Corning	10-013-CV	* Used for maintaining HeLa Cell
DMEM**	Gibco	11965-092	**Used for bacterial infection in presence of ncAA, see section 5.4.
DMSO	Sigma-Aldrich	D8418	250 g
Donkey anti-rabbit Alexa fluoro555 secondary antibody	Invitrogen	A-31572
DPBS, 1x	Corning	21-031-CV
E. coli strain BL21 (DE3)	Novagen (Madison, WI)
EMCCD Camera	Andor	iXon Ultra 897-BV
Eppendorf Safe-Lock Tube 1.5 mL (PCR clean)	Eppendorf, Hamburg, Germany	30123.328
Fetal Bovine Serum (FBS)	Fischer	10082147
Fisherbrand Syringe Filters – Sterile (PVDF 0.22 µm)	Fischer Scientific	97203	Pack of 100
Gene Pulser Xcell Electroporator	BIO-RAD	1652660
Gentamycin	Sigma-Aldrich	G1272	10 mL
Gibco L-Glutamine (200 mM), 100x	Fischer Scientific	25-030-081
Glucose oxidase	Sigma-Aldrich	G7141-50KU
Glycerol	Fischer Scientific	BF229-4
HeLa cells	ATTC	CCL-2
HEPES Buffer	Corning	25-060-C1	100 mL
Hydrocloric acid	Fischer Scientific	A144-212
ImageJ			Image processing and analysis:  http://rsbweb.nih.gov/ij
IntantBlue	Expedeon	ISB1L	Coomassie-based stain
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)	Sigma-Aldrich	I5502
Janelia Fluoro 646-tetrazine	Tocris Bioscience	7279
Kanamycin	Sigma-Aldrich	60615	5 g
LB Broth	BD Difco	244620	500 g
Lysozyme	Sigma-Aldrich	L6876
μManager (v. 1.4.2)			https://micro-manager.org/Download_Micro-Manager_Latest_Release
MES	Sigma-Aldrich	M3671	250 g
Micro pulser cuvette	BIO-RAD	165-2086	0.2 cm electrode gap, pkg. of 50
Nikon N-STORM	Nikon Instruments Inc.		https://www.microscope.healthcare.nikon.com/products/super-resolution-microscopes/n-storm-super-resolution
Nunc EasYFlask Cell Culture Flasks	ThermiFischer Scientific	156499
Omnipur Casamino Acid	Calbiochem	2240	500 g
Paraformaldehhyde (PFA)	Electron Microscopy Sciences	15710
PBS (10x)	Roche	11666789001
Penicillin-Streptomycin Solution (100x)	GenDEPOT	CA005-010	100 mL
pEVOL-PylRS-AF			For plasmid construction and map see following references 1. Angew Chem Int Ed Engl. 2011, 50(17), 3878-81. 2. Angew Chem Int Ed Engl., 2012, 51, 4166-70.
Plasmid Mini-prep Kit	Qiagen	27106
plasmid pWSK29-sseJ10TAG-HA			Ref.: elife. 2021, 10, e67789.
plasmid pWSK29-sseJ-HA			Ref.: elife. 2021, 10, e67789.                                                                   Vector map of PWSK29: https://www.addgene.org/172972/
Pluronic F-127	Millipore	540025	Protein grade, 10% Solution
Potassium phosphate monobasic	Fischer Scientific	P285-500
Potassium sulphate	Acros Organic	424220250
Protease Inhibitor Cocktail Set I – Calbiochem	Sigma-Aldrich	539131	100x Solution
Rabbit anti-HA primary antibody	Sigma-Aldrich	H6908
S. enterica. serovar Typhimurium 14028s			Ref.: PLoS Biol. 2015, 13, e1002116.
Saponin	Sigma-Aldrich	47036-50G-F
Sodium dodecyl sulfate (SDS)	Sigma-Aldrich	L3771
Sodium hydroxide	Fischer Scientific	SS255-1
Sodium Pyruvate (100 mM), 100x	Corning	25-060-C1	100 mL
Sonic Dismembrator Model 100	Fischer Scientific	24932
STED microsocpe (Leica TCS SP8 STED 3X system)	Leica Microsystems, Wetzlar, Germany		https://www.leica-microsystems.com/products/confocal-microscopes/p/leica-tcs-sp8-sted-one/
ThunderSTORM			https://zitmen.github.io/thunderstorm/
Trizma Base	Sigma-Aldrich	T1503
Trypsin-EDTA (1x), 0.25%	GenDEPOT	CA014-010
Tween-20	Sigma-Aldrich	P9416	100 mL
X-well tissue culture chamber slides	SARSTEDT	94.6190.802