Imaging a super-risoluzione di proteine secrete da batteri utilizzando l'espansione del codice genetico

Summary

Questo articolo fornisce un protocollo semplice e chiaro per marcare gli effettori secreti da Salmonella utilizzando l’espansione del codice genetico (GCE) in modo specifico per il sito e visualizzare la localizzazione subcellulare delle proteine secrete nelle cellule HeLa utilizzando la microscopia a ricostruzione ottica stocastica diretta (dSTORM)

Abstract

I sistemi di secrezione di tipo tre (T3SS) consentono ai batteri gram-negativi di iniettare una batteria di proteine effettrici direttamente nel citosol delle cellule ospiti eucariotiche. All’ingresso, le proteine effettrici iniettate modulano in modo cooperativo le vie di segnalazione eucariotiche e riprogrammano le funzioni cellulari, consentendo l’ingresso e la sopravvivenza dei batteri. Il monitoraggio e la localizzazione di queste proteine effettrici secrete nel contesto delle infezioni fornisce un’impronta per definire l’interfaccia dinamica delle interazioni ospite-patogeno. Tuttavia, l’etichettatura e l’imaging delle proteine batteriche nelle cellule ospiti senza interrompere la loro struttura / funzione è tecnicamente impegnativo.

La costruzione di proteine di fusione fluorescenti non risolve questo problema, perché le proteine di fusione bloccano l’apparato secretorio e quindi non vengono secrete. Per superare questi ostacoli, abbiamo recentemente impiegato un metodo per la marcatura fluorescente sito-specifica di effettori secreti batterici, così come altre proteine difficili da etichettare, utilizzando l’espansione del codice genetico (GCE). Questo documento fornisce un protocollo passo-passo completo per marcare gli effettori secreti da Salmonella utilizzando GCE site-specific, seguito da istruzioni per l’imaging della localizzazione subcellulare delle proteine secrete nelle cellule HeLa utilizzando la microscopia a ricostruzione ottica stocastica diretta (dSTORM)

Recenti scoperte suggeriscono che l’incorporazione di aminoacidi non canonici (ncAA) tramite GCE, seguita da marcatura bio-ortogonale con coloranti contenenti tetrazina, è una tecnica praticabile per la marcatura selettiva e la visualizzazione delle proteine secrete batteriche e la successiva analisi delle immagini nell’ospite. L’obiettivo di questo articolo è quello di fornire un protocollo semplice e chiaro che possa essere impiegato dai ricercatori interessati a condurre immagini a super-risoluzione utilizzando GCE per studiare vari processi biologici in batteri e virus, nonché le interazioni ospite-patogeno.

Introduction

Le infezioni batteriche sono state a lungo considerate un grave pericolo per la salute umana. I patogeni utilizzano sistemi di difesa altamente evoluti, estremamente potenti e intricati, nonché una varietà di fattori di virulenza batterica (indicati come proteine effettrici) per eludere le risposte immunitarie dell’ospite e stabilire infezioni ^1,2. Tuttavia, i meccanismi molecolari alla base di questi sistemi e il ruolo delle singole proteine effettrici sono ancora in gran parte sconosciuti a causa della mancanza di approcci adeguati per seguire direttamente i componenti proteici cruciali e gli effettori nelle cellule ospiti durante la patogenesi.

Un esempio tipico è Salmonella enterica sierotipo Typhimurium, che causa gastroenterite acuta. Salmonella Typhimurium utilizza sistemi di secrezione di tipo tre (T3SS) per iniettare una varietà di proteine effettrici direttamente nelle cellule ospiti. Non appena la Salmonella entra nella cellula ospite, risiede in un compartimento legato alla membrana acida, chiamato vacuolo contenente Salmonella (SCV)^3,4. Il pH acido dell’SCV attiva il T3SS codificato per l’isola di patogenicità della Salmonella 2 (SPI-2) e trasloca una raffica di 20 o più proteine effettrici attraverso la membrana vacuolare nel citosol ospite 5,6,7,8. All’interno dell’ospite, questi complessi cocktail di proteine effettrici manipolano coordinatamente le vie di segnalazione delle cellule ospiti, con conseguente formazione di strutture di membrana tubulari altamente dinamiche e complesse estese dall’SCV lungo i microtubuli, chiamati filamenti indotti da Salmonella (SIF), che consentono alla Salmonella di sopravvivere e replicarsi all’interno delle cellule ospiti 9,10,11.

I metodi per visualizzare, tracciare e monitorare le localizzazioni degli effettori batterici ed esaminare il loro traffico e le interazioni all’interno delle cellule ospiti, forniscono informazioni critiche sui meccanismi alla base della patogenesi batterica. La marcatura e la localizzazione delle proteine effettrici T3SS secrete da Salmonella all’interno delle cellule ospiti si è dimostrata una sfida tecnologica^12,13; Tuttavia, lo sviluppo di proteine fluorescenti codificate geneticamente ha trasformato la nostra capacità di studiare e visualizzare le proteine all’interno dei sistemi viventi. Tuttavia, la dimensione delle proteine fluorescenti (~25-30 kDa)15 è spesso paragonabile o addirittura superiore a quella della proteina di interesse (POI; ad esempio, ^13,65 kDa per SsaP, 37,4 kDa per SifA). Infatti, la marcatura fluorescente delle proteine degli effettori spesso blocca la secrezione dell’effettore marcato e blocca il T3SS¹⁴.

Inoltre, le proteine fluorescenti sono meno stabili ed emettono un basso numero di fotoni prima del fotosbiancamento, limitando il loro uso nelle tecniche microscopiche a super-risoluzione^16,17,18, in particolare nella microscopia di localizzazione della fotoattivazione (PALM), STORM e microscopia STED (stimolation emission depletion). Mentre le proprietà fotofisiche dei coloranti fluorescenti organici sono superiori a quelle delle proteine fluorescenti, metodi / tecniche come CLIP / SNAP^19,20, Split-GFP 21, ReAsH / FlAsH 22,23 e HA-Tags ^24,25 richiedono un’appendice proteica o peptidica aggiuntiva che può compromettere la struttura-funzione della proteina effettrice di interesse interferendo con la modifica o il traffico post-traduzionale. Un metodo alternativo che riduce al minimo la necessaria modificazione proteica comporta l’incorporazione di ncAA in un POI durante la traduzione attraverso GCE. Gli ncAA sono fluorescenti o possono essere resi fluorescenti tramite chimica a scatto 12,13,26,27,28.

Utilizzando la GCE, le ncAA con gruppi piccoli, funzionali, bio-ortogonali (come un gruppo azide, ciclopropene o cicloottino) possono essere introdotte in quasi tutte le posizioni in una proteina bersaglio. In questa strategia, un codone nativo viene scambiato con un codone raro come un codone di arresto ambrato (TAG) in una posizione specifica nel gene del POI. La proteina modificata viene successivamente espressa nelle cellule insieme a una coppia ortogonale amminoacil-tRNA sintetasi/tRNA. Il sito attivo della tRNA sintetasi è progettato per ricevere solo un particolare ncAA, che viene quindi attaccato covalentemente all’estremità 3′ del tRNA che riconosce il codone ambrato. L’ncAA viene semplicemente introdotto nel mezzo di crescita, ma deve essere assorbito dalla cellula e raggiungere il citosol dove l’amminoacil-tRNA sintetasi (aaRS) può collegarlo al tRNA ortogonale; viene quindi incorporato nel PDI nella posizione specificata (vedere Figura 1)¹². Pertanto, GCE consente l’incorporazione sito-specifica di una pletora di gruppi reattivi bio-ortogonali come chetone, azide, alchino, cicloottino, transciclooctene, tetrazina, norbonene, α, ammide β-insatura e biciclo [6.1.0]-nonyne in un POI, superando potenzialmente i limiti dei metodi convenzionali di etichettatura delle proteine 12,26,27,28.

Le recenti tendenze emergenti nelle tecniche di imaging a super-risoluzione hanno aperto nuove strade per studiare le strutture biologiche a livello molecolare. In particolare, STORM, una tecnica a super-risoluzione basata sulla localizzazione, è diventata uno strumento inestimabile per visualizzare strutture cellulari fino a ~ 20-30 nm ed è in grado di studiare i processi biologici una molecola alla volta, scoprendo così i ruoli delle molecole intracellulari che sono ancora sconosciuti negli studi tradizionali con media di ensemble¹³ . Le tecniche a singola molecola e super-risoluzione richiedono un piccolo tag con fluorofori organici luminosi e fotostabili per la migliore risoluzione. Abbiamo recentemente dimostrato che GCE può essere utilizzato per incorporare sonde adatte per l’imaging a super-risoluzione¹².

Due delle migliori scelte per la marcatura delle proteine nelle cellule sono biciclo [6.1.0] noninilisina (BCN) e trans-ciclooctene-lisina (TCO; mostrato in Figura 1), che può essere geneticamente codificato usando una variante della coppia tRNA/sintetasi (qui chiamata tRNA^{Pyl/PylRS AF}), dove Pyl rappresenta la pirrolisina, e AF rappresenta un doppio mutante razionalmente progettato (Y306A, Y384F) derivato da Methanosarcina mazei che codifica naturalmente la pirrolisina^12, 29,30,31. Attraverso la reazione di cicloaddizione di Diels-Alder (SPIEDAC) promossa dalla tensione inversa, questi amminoacidi reagiscono chesomelettivamente con i coniugati tetrazina (Figura 1)12,30,31. Tali reazioni di cicloaddizione sono eccezionalmente veloci e compatibili con le cellule viventi; Possono anche essere fluorogenici, se un fluoroforo appropriato è funzionalizzato con la porzione di tetrazina^12,26,32. Questo articolo presenta un protocollo ottimizzato per il monitoraggio della dinamica degli effettori batterici consegnati nelle cellule ospiti utilizzando GCE, seguito dalla localizzazione subcellulare delle proteine secrete nelle cellule HeLa utilizzando dSTORM. I risultati indicano che l’incorporazione di un ncAA tramite GCE, seguita da una reazione a clic con coloranti fluorogenici contenenti tetrazina, rappresenta un metodo versatile per la marcatura selettiva, la visualizzazione delle proteine secrete e la successiva localizzazione subcellulare nell’ospite. Tutti i componenti e le procedure qui descritti possono tuttavia essere adattati o sostituiti in modo che il sistema GCE possa essere adattato per indagare su altre questioni biologiche.

Protocol

1. Costruzione plasmidica Clonare il gene che esprime il POI in un plasmide di espressione (ad esempio, pET28a-sseJ 10TAG) che esprime il POI in E. coli BL21 (DE3). Questo passaggio facilita nel determinare che i mutanti sono funzionali. Per la visualizzazione degli effettori secreti da Salmonella nelle cellule ospiti, costruire un plasmide di espressione (pWSK29-sseJ-HA) che esprima il POI bersaglio SseJ sotto il controllo del suo promotore nativo,…

Representative Results

Questo documento protocollare descrive un metodo basato su GCE per l’etichettatura fluorescente sito-specifica e la visualizzazione degli effettori secreti da Salmonella , come illustrato nella Figura 1. La struttura chimica del gruppo bioortogonale (TCO) transciclooctene contenente ncAA e del colorante fluorescente sono mostrati nella Figura 1A. La marcatura di SseJ è stata ottenuta mediante incorporazione genetica di …

Discussion

L’approccio qui descritto è stato utilizzato per tracciare la posizione precisa delle proteine effettrici iniettate nella cellula ospite dal batterico T3SS dopo l’infezione. I T3SS sono impiegati da patogeni intracellulari come Salmonella, Shigella e Yersinia per trasportare componenti di virulenza nell’ospite. Lo sviluppo di tecnologie di imaging a super-risoluzione ha permesso di visualizzare fattori di virulenza con una risoluzione precedentemente inimmaginabile^{12,13,24</s…}

Materials

10x Tris/Glycine SDS running buffer	BIO-RAD	1610732
Ammonium chloride	Fischer Scientific	A661-500
Ammonium sulphate	Fischer Scientific	BP212R-1
Ampicillin Sodium	Sigma-Aldrich	A0166	5 g
Antibiotic-Antimycotic (100x)	ThermiFischer Scientific	15240096
Arabinose	Sigma-Aldrich	A3256	500 g
Avanti J-26XP (High-Performance Centrifuge)	Beckman Coulter
Bacto-Agar	BD Diagnostics, Franklin Lakes, USA	214010
BDP-FL-tetrazine	Lumiprobe (USA)	2.14E+02
β-mercaptoethanol	Millipore	444203	250 mL
Bromophenol blue	Sigma-Aldrich	B8026
BSA	Sigma-Aldrich	A4503	500 g
Casein	Sigma-Aldrich	C8654
Catalase	Sigma-Aldrich	C9322
Chloramphenicol	Sigma-Aldrich	C1919
Click Amino Acid / trans-Cyclooct-2-en – L – Lysine (TCO*A)	SiChem GmbH	SC-8008	Size: 500 mg
DAPI (Hoechst33342)	Invitrogen	H3570
DeNovix DS-11+ Spectrophotometer	DeNovix
DMEM*	Corning	10-013-CV	* Used for maintaining HeLa Cell
DMEM**	Gibco	11965-092	**Used for bacterial infection in presence of ncAA, see section 5.4.
DMSO	Sigma-Aldrich	D8418	250 g
Donkey anti-rabbit Alexa fluoro555 secondary antibody	Invitrogen	A-31572
DPBS, 1x	Corning	21-031-CV
E. coli strain BL21 (DE3)	Novagen (Madison, WI)
EMCCD Camera	Andor	iXon Ultra 897-BV
Eppendorf Safe-Lock Tube 1.5 mL (PCR clean)	Eppendorf, Hamburg, Germany	30123.328
Fetal Bovine Serum (FBS)	Fischer	10082147
Fisherbrand Syringe Filters – Sterile (PVDF 0.22 µm)	Fischer Scientific	97203	Pack of 100
Gene Pulser Xcell Electroporator	BIO-RAD	1652660
Gentamycin	Sigma-Aldrich	G1272	10 mL
Gibco L-Glutamine (200 mM), 100x	Fischer Scientific	25-030-081
Glucose oxidase	Sigma-Aldrich	G7141-50KU
Glycerol	Fischer Scientific	BF229-4
HeLa cells	ATTC	CCL-2
HEPES Buffer	Corning	25-060-C1	100 mL
Hydrocloric acid	Fischer Scientific	A144-212
ImageJ			Image processing and analysis:  http://rsbweb.nih.gov/ij
IntantBlue	Expedeon	ISB1L	Coomassie-based stain
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)	Sigma-Aldrich	I5502
Janelia Fluoro 646-tetrazine	Tocris Bioscience	7279
Kanamycin	Sigma-Aldrich	60615	5 g
LB Broth	BD Difco	244620	500 g
Lysozyme	Sigma-Aldrich	L6876
μManager (v. 1.4.2)			https://micro-manager.org/Download_Micro-Manager_Latest_Release
MES	Sigma-Aldrich	M3671	250 g
Micro pulser cuvette	BIO-RAD	165-2086	0.2 cm electrode gap, pkg. of 50
Nikon N-STORM	Nikon Instruments Inc.		https://www.microscope.healthcare.nikon.com/products/super-resolution-microscopes/n-storm-super-resolution
Nunc EasYFlask Cell Culture Flasks	ThermiFischer Scientific	156499
Omnipur Casamino Acid	Calbiochem	2240	500 g
Paraformaldehhyde (PFA)	Electron Microscopy Sciences	15710
PBS (10x)	Roche	11666789001
Penicillin-Streptomycin Solution (100x)	GenDEPOT	CA005-010	100 mL
pEVOL-PylRS-AF			For plasmid construction and map see following references 1. Angew Chem Int Ed Engl. 2011, 50(17), 3878-81. 2. Angew Chem Int Ed Engl., 2012, 51, 4166-70.
Plasmid Mini-prep Kit	Qiagen	27106
plasmid pWSK29-sseJ10TAG-HA			Ref.: elife. 2021, 10, e67789.
plasmid pWSK29-sseJ-HA			Ref.: elife. 2021, 10, e67789.                                                                   Vector map of PWSK29: https://www.addgene.org/172972/
Pluronic F-127	Millipore	540025	Protein grade, 10% Solution
Potassium phosphate monobasic	Fischer Scientific	P285-500
Potassium sulphate	Acros Organic	424220250
Protease Inhibitor Cocktail Set I – Calbiochem	Sigma-Aldrich	539131	100x Solution
Rabbit anti-HA primary antibody	Sigma-Aldrich	H6908
S. enterica. serovar Typhimurium 14028s			Ref.: PLoS Biol. 2015, 13, e1002116.
Saponin	Sigma-Aldrich	47036-50G-F
Sodium dodecyl sulfate (SDS)	Sigma-Aldrich	L3771
Sodium hydroxide	Fischer Scientific	SS255-1
Sodium Pyruvate (100 mM), 100x	Corning	25-060-C1	100 mL
Sonic Dismembrator Model 100	Fischer Scientific	24932
STED microsocpe (Leica TCS SP8 STED 3X system)	Leica Microsystems, Wetzlar, Germany		https://www.leica-microsystems.com/products/confocal-microscopes/p/leica-tcs-sp8-sted-one/
ThunderSTORM			https://zitmen.github.io/thunderstorm/
Trizma Base	Sigma-Aldrich	T1503
Trypsin-EDTA (1x), 0.25%	GenDEPOT	CA014-010
Tween-20	Sigma-Aldrich	P9416	100 mL
X-well tissue culture chamber slides	SARSTEDT	94.6190.802