Super-Resolution-Bildgebung von bakteriell sezernierten Proteinen mittels genetischer Code-Expansion
Summary
Dieser Artikel bietet ein einfaches und klares Protokoll zur ortsspezifischen Markierung von Salmonella-sezernierten Effektoren mittels genetischer Code-Expansion (GCE) und zur Abbildung der subzellulären Lokalisation von sezernierten Proteinen in HeLa-Zellen mit Hilfe der direkten stochastischen optischen Rekonstruktionsmikroskopie (dSTORM)
Abstract
Typ-Drei-Sekretionssysteme (T3SSs) ermöglichen es gramnegativen Bakterien, eine Batterie von Effektorproteinen direkt in das Zytosol eukaryotischer Wirtszellen zu injizieren. Beim Eintritt modulieren die injizierten Effektorproteine kooperativ eukaryotische Signalwege und programmieren zelluläre Funktionen um, was das Eindringen und Überleben von Bakterien ermöglicht. Die Beobachtung und Lokalisierung dieser sezernierten Effektorproteine im Kontext von Infektionen liefert einen Fußabdruck für die Definition der dynamischen Schnittstelle von Wirt-Pathogen-Interaktionen. Die Markierung und Bildgebung bakterieller Proteine in Wirtszellen ohne Störung ihrer Struktur/Funktion ist jedoch technisch anspruchsvoll.
Die Konstruktion fluoreszierender Fusionsproteine löst dieses Problem nicht, da die Fusionsproteine den sekretorischen Apparat blockieren und somit nicht sezerniert werden. Um diese Hindernisse zu überwinden, haben wir kürzlich eine Methode zur ortsspezifischen Fluoreszenzmarkierung von bakteriell sezernierten Effektoren sowie anderen schwer zu markierenden Proteinen unter Verwendung der genetischen Code-Expansion (GCE) eingesetzt. Diese Arbeit bietet ein vollständiges Schritt-für-Schritt-Protokoll zur Markierung von Salmonella-sezernierten Effektoren mit GCE-Ortsspezifischkeit, gefolgt von Anweisungen zur Abbildung der subzellulären Lokalisation von sezernierten Proteinen in HeLa-Zellen mit Hilfe der direkten stochastischen optischen Rekonstruktionsmikroskopie (dSTORM)
Neuere Ergebnisse deuten darauf hin, dass der Einbau von nicht-kanonischen Aminosäuren (ncAAs) über GCE, gefolgt von bioorthogonaler Markierung mit tetrazinhaltigen Farbstoffen, eine praktikable Technik zur selektiven Markierung und Visualisierung von bakteriell sezernierten Proteinen und anschließender Bildanalyse im Wirt ist. Das Ziel dieses Artikels ist es, ein einfaches und klares Protokoll bereitzustellen, das von Forschern verwendet werden kann, die daran interessiert sind, hochauflösende Bildgebung mit GCE durchzuführen, um verschiedene biologische Prozesse in Bakterien und Viren sowie Wirt-Pathogen-Interaktionen zu untersuchen.
Introduction
Bakterielle Infektionen gelten seit langem als ernsthafte Gefahr für die menschliche Gesundheit. Krankheitserreger nutzen hochentwickelte, extrem leistungsfähige und komplizierte Abwehrsysteme sowie eine Vielzahl von bakteriellen Virulenzfaktoren (sogenannte Effektorproteine), um der Immunantwort des Wirts zu entgehen und Infektionen zu verursachen 1,2. Die molekularen Mechanismen, die diesen Systemen zugrunde liegen, und die Rolle einzelner Effektorproteine sind jedoch noch weitgehend unbekannt, da es an geeigneten Ansätzen mangelt, um die entscheidenden Proteinkomponenten und Effektoren in Wirtszellen während der Pathogenese direkt zu verfolgen.
Ein typisches Beispiel ist Salmonella enterica serovar Typhimurium, das eine akute Gastroenteritis verursacht. Salmonelle Typhimurium nutzt Typ-Drei-Sekretionssysteme (T3SS), um eine Vielzahl von Effektorproteinen direkt in Wirtszellen zu injizieren. Sobald Salmonellen in die Wirtszelle eindringen, befinden sie sich in einem sauren, membrangebundenen Kompartiment, das als Salmonellen-haltige Vakuole (SCV) bezeichnet wird3,4. Der saure pH-Wert des SCV aktiviert das Salmonella pathogenicity island 2 (SPI-2)-kodierte T3SS und transloziert eine Salve von 20 oder mehr Effektorproteinen über die vakuoläre Membran in das Wirtszytosol 5,6,7,8. Im Inneren des Wirts manipulieren diese komplexen Cocktails von Effektorproteinen koordiniert die Signalwege der Wirtszelle, was zur Bildung hochdynamischer, komplexer röhrenförmiger Membranstrukturen führt, die sich vom SCV entlang von Mikrotubuli erstrecken, die als Salmonellen-induzierte Filamente (SIFs) bezeichnet werden und es Salmonellen ermöglichen, in den Wirtszellen zu überleben und sich zu vermehren 9,10,11.
Methoden zur Visualisierung, Verfolgung und Überwachung bakterieller Effektorlokalisationen sowie zur Untersuchung ihres Transports und ihrer Interaktionen innerhalb von Wirtszellen bieten wichtige Einblicke in die Mechanismen, die der bakteriellen Pathogenese zugrunde liegen. Die Markierung und Lokalisierung von Salmonella-sezernierten T3SS-Effektorproteinen in Wirtszellen hat sich als technologische Herausforderung erwiesen 12,13; Nichtsdestotrotz hat die Entwicklung genetisch kodierter fluoreszierender Proteine unsere Fähigkeit verändert, Proteine in lebenden Systemen zu untersuchen und sichtbar zu machen. Die Größe fluoreszierender Proteine (~25-30 kDa)15 ist jedoch oft vergleichbar mit der des interessierenden Proteins (POI; z. B. 13,65 kDa für SsaP, 37,4 kDa für SifA). Tatsächlich blockiert die fluoreszierende Proteinmarkierung von Effektoren oft die Sekretion des markierten Effektors und blockiert das T3SS14.
Darüber hinaus sind fluoreszierende Proteine weniger stabil und emittieren vor dem Photobleichen eine geringe Anzahl von Photonen, was ihre Verwendung in hochauflösenden mikroskopischen Techniken einschränkt16,17,18, insbesondere in der Photoaktivierungs-Lokalisierungsmikroskopie (PALM), STORM und STED-Mikroskopie (Stimulated Emission Depletion). Während die photophysikalischen Eigenschaften organischer Fluoreszenzfarbstoffe denen von fluoreszierenden Proteinen überlegen sind, erfordern Methoden/Techniken wie CLIP/SNAP19,20, Split-GFP 21, ReAsH/FlAsH 22,23 und HA-Tags24,25 ein zusätzliches Protein- oder Peptidanhang, das die Strukturfunktion des interessierenden Effektorproteins beeinträchtigen kann, indem es die posttranslationale Modifikation oder den Transport stört. Eine alternative Methode, die die notwendige Proteinmodifikation minimiert, ist der Einbau von ncAAs in einen POI während der Translation durch GCE. Die ncAAs sind entweder fluoreszierend oder können mittels Click-Chemie fluoreszierend gemacht werden 12,13,26,27,28.
Mit Hilfe von GCE können ncAAs mit winzigen, funktionellen, bioorthogonalen Gruppen (wie z. B. einer Azid-, Cyclopropen- oder Cyclooctingruppe) an nahezu jeder Stelle in einem Zielprotein eingeführt werden. Bei dieser Strategie wird ein natives Codon mit einem seltenen Codon, wie z.B. einem bernsteinfarbenen (TAG) Stoppcodon an einer bestimmten Position im Gen des POI ausgetauscht. Das modifizierte Protein wird anschließend zusammen mit einem orthogonalen Aminoacyl-tRNA-Synthetase/tRNA-Paar in Zellen exprimiert. Das aktive Zentrum der tRNA-Synthetase ist so konzipiert, dass es nur ein bestimmtes ncAA erhält, das dann kovalent an das 3′-Ende der tRNA gebunden wird, das das Bernsteincodon erkennt. Das ncAA wird einfach in das Wachstumsmedium eingebracht, muss aber von der Zelle aufgenommen werden und das Zytosol erreichen, wo die Aminoacyl-tRNA-Synthetase (aaRS) es mit der orthogonalen tRNA verknüpfen kann. es wird dann an der angegebenen Stelle in den POI eingebunden (siehe Abbildung 1)12. Somit ermöglicht GCE den ortsspezifischen Einbau einer Vielzahl von bioorthogonalen reaktiven Gruppen wie Keton, Azid, Alkin, Cyclooctin, Transcycloocten, Tetrazin, Norboneen, α, β-ungesättigtes Amid und Bicyclo [6.1.0]-Nonin in einen POI, wodurch möglicherweise die Einschränkungen herkömmlicher Proteinmarkierungsmethoden überwundenwerden 12,26,27,28.
Die jüngsten Trends bei hochauflösenden Bildgebungsverfahren haben neue Wege zur Untersuchung biologischer Strukturen auf molekularer Ebene eröffnet. Insbesondere STORM, eine auf Lokalisierung basierende, superauflösende Einzelmolekültechnik, hat sich zu einem unschätzbaren Werkzeug zur Visualisierung zellulärer Strukturen bis hinunter zu ~20-30 nm entwickelt und ist in der Lage, biologische Prozesse Molekül für Molekül zu untersuchen und dadurch die Rolle intrazellulärer Moleküle zu entdecken, die in traditionellen ensemblegemittelten Studien noch unbekannt sind13 . Einzelmolekül- und Super-Resolution-Techniken erfordern eine kleine Markierung mit hellen, photostabilen organischen Fluorophoren, um die beste Auflösung zu erzielen. Wir haben kürzlich gezeigt, dass GCE für die Integration geeigneter Sonden für die hochauflösende Bildgebung verwendet werden kann12.
Zwei der besten Optionen für die Proteinmarkierung in Zellen sind Bicyclo [6.1.0]nonynelysin (BCN) und trans-Cycloocten-Lysin (TCO; siehe Abbildung 1), die genetisch mit einer Variante des tRNA/Synthetase-Paares (hier als tRNAPyl/PylRS AF bezeichnet) kodiert werden können, wobei Pyl für Pyrrolysin steht undAF für eine rational gestaltete Doppelmutante (Y306A, Y384F) steht, die von Methanosarcina mazei abgeleitet ist und auf natürliche Weise für Pyrrolysin12 kodiert. 29,30,31. Durch die dehnungsgeförderte inverse Elektronenbedarfs-Diels-Alder-Cycloadditionsreaktion (SPIEDAC) reagieren diese Aminosäuren chemoselektiv mit Tetrazin-Konjugaten (Abbildung 1)12,30,31. Solche Cycloadditionsreaktionen sind außergewöhnlich schnell und mit lebenden Zellen kompatibel; Sie können auch fluorogen sein, wenn ein geeigneter Fluorophor mit der Tetrazin-Einheit12,26,32 funktionalisiert wird. In dieser Arbeit wird ein optimiertes Protokoll zur Überwachung der Dynamik von bakteriellen Effektoren vorgestellt, die mittels GCE in Wirtszellen eingebracht werden, gefolgt von der subzellulären Lokalisierung von sezernierten Proteinen in HeLa-Zellen unter Verwendung von dSTORM. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass der Einbau eines ncAA über GCE, gefolgt von einer Click-Reaktion mit fluorogenen Tetrazin-haltigen Farbstoffen, eine vielseitige Methode zur selektiven Markierung, Visualisierung sezernierter Proteine und anschließender subzellulärer Lokalisation im Wirt darstellt. Alle hier beschriebenen Komponenten und Verfahren können jedoch angepasst oder ersetzt werden, so dass das GCE-System für die Untersuchung anderer biologischer Fragestellungen angepasst werden kann.
Protocol
Representative Results
Discussion
Der hier beschriebene Ansatz wurde verwendet, um die genaue Position von Effektorproteinen zu verfolgen, die nach der Infektion vom bakteriellen T3SS in die Wirtszelle injiziert werden. T3SSs werden von intrazellulären Krankheitserregern wie Salmonellen, Shigellen und Yersinien eingesetzt, um Virulenzkomponenten in den Wirt zu transportieren. Die Entwicklung von hochauflösenden Bildgebungstechnologien hat es möglich gemacht, Virulenzfaktoren mit einer bisher unvorstellbaren Auflösung sichtb…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde durch Anschubfinanzierungen der University of Texas Medical Branch, Galveston, TX, und einen Texas STAR Award an L.J.K. Wir danken Prof. Edward Lemke (European Molecular Biology Laboratory, Heidelberg, Deutschland) für das Plasmid pEVOL-PylRS-AF. Die Bilder in Abbildung 1 wurden mit BioRender erstellt.
Materials
| 10x Tris/Glycine SDS running buffer | BIO-RAD | 1610732 | |
| Ammonium chloride | Fischer Scientific | A661-500 | |
| Ammonium sulphate | Fischer Scientific | BP212R-1 | |
| Ampicillin Sodium | Sigma-Aldrich | A0166 | 5 g |
| Antibiotic-Antimycotic (100x) | ThermiFischer Scientific | 15240096 | |
| Arabinose | Sigma-Aldrich | A3256 | 500 g |
| Avanti J-26XP (High-Performance Centrifuge) | Beckman Coulter | ||
| Bacto-Agar | BD Diagnostics, Franklin Lakes, USA | 214010 | |
| BDP-FL-tetrazine | Lumiprobe (USA) | 2.14E+02 | |
| β-mercaptoethanol | Millipore | 444203 | 250 mL |
| Bromophenol blue | Sigma-Aldrich | B8026 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | A4503 | 500 g |
| Casein | Sigma-Aldrich | C8654 | |
| Catalase | Sigma-Aldrich | C9322 | |
| Chloramphenicol | Sigma-Aldrich | C1919 | |
| Click Amino Acid / trans-Cyclooct-2-en – L – Lysine (TCO*A) | SiChem GmbH | SC-8008 | Size: 500 mg |
| DAPI (Hoechst33342) | Invitrogen | H3570 | |
| DeNovix DS-11+ Spectrophotometer | DeNovix | ||
| DMEM* | Corning | 10-013-CV | * Used for maintaining HeLa Cell |
| DMEM** | Gibco | 11965-092 | **Used for bacterial infection in presence of ncAA, see section 5.4. |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D8418 | 250 g |
| Donkey anti-rabbit Alexa fluoro555 secondary antibody | Invitrogen | A-31572 | |
| DPBS, 1x | Corning | 21-031-CV | |
| E. coli strain BL21 (DE3) | Novagen (Madison, WI) | ||
| EMCCD Camera | Andor | iXon Ultra 897-BV | |
| Eppendorf Safe-Lock Tube 1.5 mL (PCR clean) | Eppendorf, Hamburg, Germany | 30123.328 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Fischer | 10082147 | |
| Fisherbrand Syringe Filters – Sterile (PVDF 0.22 µm) | Fischer Scientific | 97203 | Pack of 100 |
| Gene Pulser Xcell Electroporator | BIO-RAD | 1652660 | |
| Gentamycin | Sigma-Aldrich | G1272 | 10 mL |
| Gibco L-Glutamine (200 mM), 100x | Fischer Scientific | 25-030-081 | |
| Glucose oxidase | Sigma-Aldrich | G7141-50KU | |
| Glycerol | Fischer Scientific | BF229-4 | |
| HeLa cells | ATTC | CCL-2 | |
| HEPES Buffer | Corning | 25-060-C1 | 100 mL |
| Hydrocloric acid | Fischer Scientific | A144-212 | |
| ImageJ | Image processing and analysis: http://rsbweb.nih.gov/ij | ||
| IntantBlue | Expedeon | ISB1L | Coomassie-based stain |
| Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | Sigma-Aldrich | I5502 | |
| Janelia Fluoro 646-tetrazine | Tocris Bioscience | 7279 | |
| Kanamycin | Sigma-Aldrich | 60615 | 5 g |
| LB Broth | BD Difco | 244620 | 500 g |
| Lysozyme | Sigma-Aldrich | L6876 | |
| μManager (v. 1.4.2) | https://micro-manager.org/Download_Micro-Manager_Latest_Release | ||
| MES | Sigma-Aldrich | M3671 | 250 g |
| Micro pulser cuvette | BIO-RAD | 165-2086 | 0.2 cm electrode gap, pkg. of 50 |
| Nikon N-STORM | Nikon Instruments Inc. | https://www.microscope.healthcare.nikon.com/products/super-resolution-microscopes/n-storm-super-resolution | |
| Nunc EasYFlask Cell Culture Flasks | ThermiFischer Scientific | 156499 | |
| Omnipur Casamino Acid | Calbiochem | 2240 | 500 g |
| Paraformaldehhyde (PFA) | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| PBS (10x) | Roche | 11666789001 | |
| Penicillin-Streptomycin Solution (100x) | GenDEPOT | CA005-010 | 100 mL |
| pEVOL-PylRS-AF | For plasmid construction and map see following references 1. Angew Chem Int Ed Engl. 2011, 50(17), 3878-81. 2. Angew Chem Int Ed Engl., 2012, 51, 4166-70. |
||
| Plasmid Mini-prep Kit | Qiagen | 27106 | |
| plasmid pWSK29-sseJ10TAG-HA | Ref.: elife. 2021, 10, e67789. | ||
| plasmid pWSK29-sseJ-HA | Ref.: elife. 2021, 10, e67789. Vector map of PWSK29: https://www.addgene.org/172972/ | ||
| Pluronic F-127 | Millipore | 540025 | Protein grade, 10% Solution |
| Potassium phosphate monobasic | Fischer Scientific | P285-500 | |
| Potassium sulphate | Acros Organic | 424220250 | |
| Protease Inhibitor Cocktail Set I – Calbiochem | Sigma-Aldrich | 539131 | 100x Solution |
| Rabbit anti-HA primary antibody | Sigma-Aldrich | H6908 | |
| S. enterica. serovar Typhimurium 14028s | Ref.: PLoS Biol. 2015, 13, e1002116. | ||
| Saponin | Sigma-Aldrich | 47036-50G-F | |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sigma-Aldrich | L3771 | |
| Sodium hydroxide | Fischer Scientific | SS255-1 | |
| Sodium Pyruvate (100 mM), 100x | Corning | 25-060-C1 | 100 mL |
| Sonic Dismembrator Model 100 | Fischer Scientific | 24932 | |
| STED microsocpe (Leica TCS SP8 STED 3X system) | Leica Microsystems, Wetzlar, Germany | https://www.leica-microsystems.com/products/confocal-microscopes/p/leica-tcs-sp8-sted-one/ | |
| ThunderSTORM | https://zitmen.github.io/thunderstorm/ | ||
| Trizma Base | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Trypsin-EDTA (1x), 0.25% | GenDEPOT | CA014-010 | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P9416 | 100 mL |
| X-well tissue culture chamber slides | SARSTEDT | 94.6190.802 |
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