Cellulaire affiniteit van deeltjesgestabiliseerde emulsie om antigeenintern internalisatie te stimuleren
Summary
Om efficiënt adjuvantia rationeel te ontwerpen, ontwikkelden we poly-melkzuur-co-glycolzuur nanodeeltjes-gestabiliseerde Pickering-emulsie (PNPE). De PNPE bezat unieke zachtheid en een hydrofobe interface voor krachtig cellulair contact en bood antigeenbelasting met een hoog gehalte, waardoor de cellulaire affiniteit van het afgiftesysteem voor antigeen-presenterende cellen werd verbeterd en efficiënte internalisatie van antigenen werd geïnduceerd.
Abstract
De cellulaire affiniteit van micro- / nanodeeltjes is de voorwaarde voor cellulaire herkenning, cellulaire opname en activering, die essentieel zijn voor medicijnafgifte en immuunrespons. De huidige studie kwam voort uit de observatie dat de effecten van lading, grootte en vorm van vaste deeltjes op celaffiniteit meestal worden overwogen, maar we realiseren ons zelden de essentiële rol van zachtheid, dynamisch herstructureringsfenomeen en complexe interface-interactie in cellulaire affiniteit. Hier ontwikkelden we poly-lactic-co-glycol acid (PLGA) nanodeeltjes-gestabiliseerde Pickering-emulsie (PNPE) die de tekortkomingen van rigide vormen overwon en de flexibiliteit en vloeibaarheid van pathogenen simuleerde. Er werd een methode opgezet om de affiniteit van PNPE met celoppervlakken te testen en de daaropvolgende internalisatie door immuuncellen uit te werken. De affiniteit van PNPE met bio-mimetische extracellulaire blaasjes (bEV’s) – de vervanging voor beenmergdendylactische cellen (BMDC’s) – werd bepaald met behulp van een kwartskristalmicrobalans met dissipatiemonitoring (QCM-D), die real-time monitoring van cel-emulsieadhesie mogelijk maakte. Vervolgens werd de PNPE gebruikt om het antigeen (ovalbumine, OVA) af te leveren en werd de opname van de antigenen door BMDC’s waargenomen met behulp van confocale laserscanmicroscoop (CLSM). Representatieve resultaten toonden aan dat de PNPE onmiddellijk de frequentie (ΔF) verminderde wanneer het de bEV’s tegenkwam, wat wijst op een snelle hechting en hoge affiniteit van de PNPE voor de BMDC’s. PNPE vertoonde een significant sterkere binding aan het celmembraan dan PLGA-microdeeltjes (PMP’s) en AddaVax-adjuvans (aangeduid als oppervlakteactieven-gestabiliseerde nano-emulsie [SSE]). Bovendien werd, als gevolg van de verbeterde cellulaire affiniteit met de immunocyten door dynamische krommingsveranderingen en laterale diffusies, de opname van antigeen vervolgens verhoogd in vergelijking met PMP’s en SSE. Dit protocol biedt inzichten voor het ontwerpen van nieuwe formuleringen met een hoge celaffiniteit en efficiënte antigeeninternalisatie, en biedt een platform voor de ontwikkeling van efficiënte vaccins.
Introduction
Om epidemische, chronische en infectieziekten te bestrijden, is het noodzakelijk om effectieve adjuvantia te ontwikkelen voor profylactische en therapeutische vaccinaties 1,2. Idealiter zouden de adjuvantia een uitstekende veiligheid en immuunactivatiemoeten hebben 3,4,5. Effectieve opname en proces van antigenen door antigeen-presenterende cellen (APC’s) worden beschouwd als een essentiële fase in de stroomafwaartse signaleringscascades en initiatie van de immuunrespons 6,7,8. Vandaar dat het verkrijgen van een duidelijk begrip van het mechanisme van interactie van immuuncellen met antigenen en het ontwerpen van adjuvantia om de internalisatie te verbeteren efficiënte strategieën zijn om de efficiëntie van vaccins te verbeteren.
Micro-/nanodeeltjes met unieke eigenschappen zijn eerder onderzocht als antigeenafgiftesystemen om de cellulaire opname van antigenen en de cellulaire interactie met pathogeen-geassocieerde moleculaire patronen te bemiddelen 9,10. Bij contact met cellen beginnen toedieningssystemen te interageren met de extracellulaire matrix en het celmembraan, wat leidde tot internalisatie en daaropvolgende cellulaire reacties11,12. Eerdere studies hebben aan het licht gebracht dat de internalisatie van deeltjes plaatsvindt door celmembraan-deeltjesadhesie13, gevolgd door flexibele vervorming van het celmembraan en diffusie van de receptor naar het oppervlaktemembraan 14,15. Onder deze omstandigheden zijn de eigenschappen van het toedieningssysteem afhankelijk van de affiniteit met APC’s, die vervolgens van invloed zijn op de opnamehoeveelheid16,17.
Om inzicht te krijgen in het ontwerp van het afgiftesysteem voor een verbeterde immuunrespons, zijn uitgebreide inspanningen gericht op het onderzoek naar de relatie tussen de eigenschappen van deeltjes en cellulaire opname. De huidige studie kwam voort uit de observatie dat vaste micro- / nanodeeltjes met verschillende ladingen, maten en vormen vaak in dit licht worden bestudeerd, terwijl de rol van vloeibaarheid in antigeeninneralisatie zelden wordt onderzocht18,19. In feite vertoonden de zachte deeltjes tijdens de hechting dynamische krommingsveranderingen en laterale diffusies om het contactoppervlak voor multivalente interacties te vergroten, die nauwelijks kunnen worden gerepliceerd door de vaste deeltjes20,21. Bovendien zijn celmembranen fosfolipide bilayers (sfingolipiden of cholesterol) op de plaats van opname, en hydrofobe stoffen kunnen de conformationele entropie van lipiden veranderen, waardoor de hoeveelheid energie die nodig is voor cellulaire opnamewordt verminderd 22,23. Het versterken van de mobiliteit en het bevorderen van hydrofobiciteit van het toedieningssysteem kan dus een effectieve strategie zijn voor het versterken van antigeeninneralisatie om de immuunrespons te verbeteren.
Pickering-emulsie, gestabiliseerd door vaste deeltjes die zijn geassembleerd op het grensvlak tussen twee onmengbare vloeistoffen, zijn op grote schaal gebruikt op biologisch gebied24,25. In feite bepalen de aggregerende deeltjes op de olie / water-interface de formulering van multi-level structuren, die multi-level delivery system-cellulaire interacties bevorderen en verder multifunctionele fysiochemische eigenschappen induceren bij medicijnafgifte. Vanwege hun vervormbaarheid en laterale mobiliteit werd verwacht dat Pickering-emulsies in multivalente cellulaire interactie met de immunocyten zouden komen en door de membraaneiwitten zouden worden herkend26. Bovendien, omdat olieachtige micelkernen in Pickering-emulsies niet volledig bedekt zijn met vaste deeltjes, bezitten Pickering-emulsies openingen van verschillende grootte tussen deeltjes op de olie / water-interface, die een hogere hydrofobiciteit veroorzaken. Het is dus cruciaal om de affiniteit van Pickering-emulsies met APC’s te onderzoeken en uit te weiden over de daaropvolgende internalisatie om efficiënte adjuvantia te ontwikkelen.
Op basis van deze overwegingen hebben we een PLGA nanodeeltjes-gestabiliseerde Pickering-emulsie (PNPE) ontworpen als een fluiditeitsvaccinafgiftesysteem dat ook heeft bijgedragen aan het verkrijgen van waardevolle inzichten in de affiniteit van de PNPE met BMDC’s en cellulaire internalisatie. De real-time hechting van bio-mimetische extracellulaire blaasjes (bEV’s; een vervanging van BMDC’s) aan PNPE werd gemonitord via een labelvrije methode met behulp van een kwartskristalmicrobalans met dissipatiemonitoring (QCM-D). Na karakterisering van de affiniteit van PNPE met BMDC’s, werd confocale laserscanmicroscopie (CLSM) gebruikt om de antigeenopname te bepalen. Het resultaat duidde op de hogere affiniteit van PNPE met BMDC’s en de efficiënte internalisatie van het antigeen. We verwachtten dat de PNPE een hogere affiniteit met APC’s zou vertonen, wat de internalisering van antigenen beter zou kunnen stimuleren om immuunresponsen te verbeteren.
Protocol
Representative Results
Discussion
We ontwikkelden PLGA nanodeeltjes-gestabiliseerde olie/water emulsie als een afgiftesysteem voor verbeterde antigeen internalisatie. De voorbereide PNPE bezat een dicht opeengepakt oppervlak om de landingsplaats te ondersteunen en unieke zachtheid en vloeibaarheid voor krachtig cellulair contact met het immuuncelmembraan. Bovendien bood de olie/water-interface een hoge gehalte aan antigeenbelasting en amfifiele PLGA verleende PNPE een hoge stabiliteit voor het transport van antigenen naar immuuncellen. De PNPE zou zich s…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door het project dat wordt ondersteund door het National Key Research and Development Program of China (2021YFE020527, 2021YFC2302605, 2021YFC2300142), From 0 to 1 Original Innovation Project of Basic Frontier Scientific Research Program of Chinese Academy of Sciences (ZDBS-LY-SLH040), de Foundation for Innovative Research Groups van de National Natural Science Foundation of China (Grant No. 21821005).
Materials
| AddVax | InvivoGen | Vac-adx-10 | |
| Cell Strainer | Biosharp | BS-70-CS | 70 μm |
| Confocal Laser Scanning Microscope (CLSM) | Nikon | A1 | |
| Cy3 NHS Ester | YEASEN | 40777ES03 | |
| DAPI Staining Solution | Beyotime | C1005 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 16000-044 | |
| FITC Phalloidin | Solarbio | CA1620 | |
| Mastersizer 2000 Particle Size Analyzer | Malvern | ||
| Micro BCA protein Assay Kit | Thermo Science | 23235 | |
| Membrane emulsification equipment | Zhongke Senhui Microsphere Technology | FM0201/500M | |
| Mini-Extruder | Avanti Polar Lipids, Inc | ||
| NANO ZS | Malvern | JSM-6700F | |
| Polycarbonate membranes | Avanti Polar Lipids, Inc | ||
| Poly (lactic-co-glycolic acid) (PLGA) | Sigma-Aldrich | 26780-50-7 | Mw 7,000-17,000 |
| Poly-L-lysine Solution | Solarbio | P2100 | |
| Poly (vinyl alcohol) (PVA) | Sigma-Aldrich | 9002-89-5 | |
| QSense Silicon dioxide sensor | Biolin Scientific | QSX 303 | Surface roughness < 1 nm RMS |
| Quartz Crystal Microbalance | Biosharp | Q-SENSE E4 | |
| RPMI Medium 1640 basic | Gibco | C22400500BT | L-Glutamine, 25 mM HEPES |
| Scanning Electron Microscopy (SEM) | JEOL | JSM-6700F | |
| Squalene | Sigma-Aldrich | 111-02-4 |
References
- Ma, G., Gu, Z., Wei, W. Advanced vaccine delivery. Advanced Drug Delivery Reviews. 183, 114170 (2022).
- Sharma, J., Carson, C. S., Douglas, T., Wilson, J. T., Joyce, S. Nano-particulate platforms for vaccine delivery to enhance antigen-specific cd8(+) t-cell response. Methods in Molecular Biology. 2412, 367-398 (2022).
- Nguyen, T. P., et al. Safety and immunogenicity of nanocovax, a sars-cov-2 recombinant spike protein vaccine: interim results of a double-blind, randomised controlled phase 1 and 2 trial. The Lancet Regional Health. Western Pacific. 24, 100474 (2022).
- Coates, E. E., et al. Safety and immunogenicity of a trivalent virus-like particle vaccine against western, eastern, and venezuelan equine encephalitis viruses: a phase 1, open-label, dose-escalation, randomised clinical trial. The Lancet Infectious Diseases. 22 (8), 1210-1220 (2022).
- Wei, L., et al. Efficacy and safety of a nanoparticle therapeutic vaccine in patients with chronic hepatitis b: a randomized clinical trial. Hepatology. 75 (1), 182-195 (2022).
- Krishnan, R., Kim, J. O., Qadiri, S. S. N., Kim, J. O., Oh, M. J. Early viral uptake and host-associated immune response in the tissues of seven-band grouper following a bath challenge with nervous necrosis virus. Fish & Shellfish Immunology. 103, 454-463 (2020).
- Mishra, D., Mishra, P. K., Dubey, V., Dabadghao, S., Jain, N. K. Evaluation of uptake and generation of immune response by murine dendritic cells pulsed with hepatitis b surface antigen-loaded elastic liposomes. Vaccine. 25 (39-40), 6939-6944 (2007).
- Harwood, L. J., Gerber, H., Sobrino, F., Summerfield, A., Mccullough, K. C. Dendritic cell internalization of foot-and-mouth disease virus: influence of heparan sulfate binding on virus uptake and induction of the immune response. Journal of Virology. 82 (13), 6379-6394 (2008).
- Jing, H., et al. Fluorescent artificial antigens revealed extended membrane networks utilized by live dendritic cells for antigen uptake. Nano Letters. 22 (10), 4020-4027 (2022).
- Meena, J., Goswami, D. G., Anish, C., Panda, A. K. Cellular uptake of polylactide particles induces size dependent cytoskeletal remodeling in antigen presenting cells. Biomaterials Science. 9 (23), 7962-7976 (2021).
- Yang, J., et al. Drug delivery via cell membrane fusion using lipopeptide modified liposomes. ACS Central Science. 2 (9), 621-630 (2016).
- Rawle, R., Kasson, P., Boxer, S. Disentangling viral membrane fusion from receptor binding by using synthetic dna-lipid conjugates totether influenza virus to model lipid membranes. Biophysical Journal. 111 (1), 123-131 (2016).
- Ha, H. K., Kim, J. W., Lee, M. R., Jun, W., Lee, W. J. Cellular uptake and cytotoxicity of β-lactoglobulin nanoparticles: the effects of particle size and surface charge. Asian-Australasian Journal of Animal Sciences. 28 (3), 420-427 (2015).
- Malara, A., et al. Extracellular matrix structure and nano-mechanics determine megakaryocyte function. Blood. 118 (16), 4449-4453 (2011).
- Dankovich, T. M., et al. Extracellular matrix remodeling through endocytosis and resurfacing of tenascin-r. Nature Communications. 12 (1), 7129 (2021).
- Evans, E., Buxbaum, K. Affinity of red-blood-cell membrane for particle surfaces measured by the extent of particle encapsulation. Biophysical Journal. 34 (1), 1-12 (1981).
- Rohner, N. A., Purdue, L. N., Von Recum, H. A. Affinity-based polymers provide long-term immunotherapeutic drug delivery across particle size ranges optimal for macrophage targeting. Journal of Pharmaceutical Sciences. 110 (4), 1693-1700 (2021).
- Zhou, X., Liu, Y., Wang, X. F., Li, X. M., Xiao, B. Effect of particle size on the cellular uptake and anti-inflammatory activity of oral nanotherapeutics. Colloids and Surfaces B-Biointerfaces. 187, 110880 (2020).
- Zhang, D., et al. The morphology and surface charge-dependent cellular uptake efficiency of upconversion nanostructures revealed by single-particle optical microscopy. Chemical Science. 13 (12), 3610 (2022).
- Xi, Y. K., et al. Co2-responsive pickering emulsions stabilized by soft protein particles for interfacial biocatalysis. Chemical Science. 13 (10), 2884-2890 (2022).
- Trivedi, R. P., Klevets, I. I., Senyuk, B., Lee, T., Smalyukh, I. I. Reconfigurable interactions and three-dimensional patterning of colloidal particles and defects in lamellar soft media. Proceedings of the National Academy of Sciences of United States of America. 109 (13), 4744-4749 (2012).
- De Araujo, A. D., Hoang, H. N., Lim, J., Mak, J. Y. W., Fairlie, D. P. Tuning electrostatic and hydrophobic surfaces of aromatic rings to enhance membrane association and cell uptake of peptides. Angewandte Chemie. 61 (29), 03995 (2022).
- Waku, T., et al. Effect of the hydrophilic-hydrophobic balance of antigen-loaded peptide nanofibers on their cellular uptake, cellular toxicity, and immune stimulatory properties. International Journal of Molecular Sciences. 20 (15), 3781 (2019).
- Meng, X., et al. A soft pickering emulsifier made from chitosan and peptides endows stimuli-responsiveness, bioactivity and biocompatibility to emulsion. Carbohydrate Polymers. 277, 118768 (2022).
- Wang, Z., et al. Fabrication and in vitro/vivo evaluation of drug nanocrystals self-stabilized pickering emulsion for oral delivery of quercetin. Pharmaceutics. 14 (5), 897 (2022).
- Ji, J., et al. Core-shell-structured silica/polyacrylate particles prepared by pickering emulsion: influence of the nucleation model on particle interfacial organization and emulsion stability. Nanoscale Research Letters. 9 (1), 534 (2014).
- Chen, l., et al. Quantitative evaluation of proteins with bicinchoninic acid (bca): resonance raman and surface-enhanced resonance raman scattering-based methods. Analyst. 137 (24), 5834-5838 (2012).
- Colino, J., Shen, Y., Snapper, C. M. Dendritic cells pulsed with intact streptococcus pneumoniae elicit both protein- and polysaccharide-specific immunoglobulin isotype responses in vivo through distinct mechanisms. The Journal of Experimental Medicine. 195 (1), 1-13 (2002).
- Zhang, Y., Wu, J., Zhang, H., Wei, J., Wu, J. Extracellular vesicles-mimetic encapsulation improves oncolytic viro-immunotherapy in tumors with low coxsackie and adenovirus receptor. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 574007 (2020).
- Cappellano, G., Abreu, H., Casale, C., Dianzani, U., Chiocchetti, A. Nano-microparticle platforms in developing next-generation vaccines. Vaccines. 9 (6), 606 (2021).
- McClelland, R. D., Culp, T. N., Marchant, D. J. Imaging flow cytometry and confocal immunofluorescence microscopy of virus-host cell interactions. Frontiers in Cellular Infection Microbiology. 11, 749039 (2021).
- Konry, T., Sarkar, S., Sabhachandani, P., Cohen, N. Innovative tools and technology for analysis of single cells and cell-cell interaction. Annual Reviews of Biomedical Engineering. 18 (1), 259-284 (2016).
- D’Aurelio, R., et al. A comparison of EIS and QCM nanoMIP-based sensors for morphine. Nanomaterials. 11 (12), 3360 (2021).
- Li, Y. J., et al. Artificial exosomes for translational nanomedicine. Journal of Nanobiotechnology. 19 (1), 242 (2021).
- Rydell, G. E., Dahlin, A. B., Hook, F., Larson, G. QCM-D studies of human norovirus VLPs binding to glycosphingolipids in supported lipid bilayers reveal strain-specific characteristics. Glycobiology. 19 (11), 1176-1184 (2009).
