Afinidad celular de la emulsión estabilizada por partículas para aumentar la internalización del antígeno
Summary
Para diseñar racionalmente adyuvantes eficientes, desarrollamos la emulsión de Pickering estabilizada con nanopartículas de ácido poliláctico-co-glicólico (PNPE). El PNPE poseía una suavidad única y una interfaz hidrófoba para un potente contacto celular y ofrecía una carga de antígenos de alto contenido, mejorando la afinidad celular del sistema de administración a las células presentadoras de antígenos e induciendo una internalización eficiente de los antígenos.
Abstract
La afinidad celular de las micro / nanopartículas es la condición previa para el reconocimiento celular, la absorción celular y la activación, que son esenciales para la administración de fármacos y la respuesta inmune. El presente estudio surgió de la observación de que generalmente se consideran los efectos de la carga, el tamaño y la forma de las partículas sólidas sobre la afinidad celular, pero rara vez nos damos cuenta del papel esencial de la suavidad, el fenómeno de reestructuración dinámica y la interacción compleja de la interfaz en la afinidad celular. Aquí, desarrollamos la emulsión de Pickering estabilizada con nanopartículas (PNPE) de ácido poliláctico-co-glicólico (PLGA) que superó las deficiencias de las formas rígidas y simuló la flexibilidad y fluidez de los patógenos. Se estableció un método para probar la afinidad de PNPE con las superficies celulares y elaborar sobre la posterior internalización por parte de las células inmunes. La afinidad de PNPE con vesículas extracelulares biomiméticas (bEV), el reemplazo de las células dendríticas de la médula ósea (BMDC), se determinó utilizando una microbalanza de cristal de cuarzo con monitoreo de disipación (QCM-D), que permitió el monitoreo en tiempo real de la adhesión de la emulsión celular. Posteriormente, se utilizó el PNPE para administrar el antígeno (ovoalbúmina, OVA) y se observó la captación de los antígenos por BMDC utilizando el microscopio de barrido láser confocal (CLSM). Los resultados representativos mostraron que el PNPE disminuyó inmediatamente la frecuencia (ΔF) cuando encontró los bEV, lo que indica una rápida adhesión y una alta afinidad del PNPE con los BMDC. PNPE mostró una unión significativamente más fuerte a la membrana celular que las micropartículas PLGA (PMP) y el adyuvante AddaVax (denotado como nanoemulsión estabilizada con surfactante [SSE]). Además, debido a la mayor afinidad celular con los inmunocitos a través de cambios dinámicos de curvatura y difusiones laterales, la captación de antígenos se incrementó posteriormente en comparación con PMP y SSE. Este protocolo proporciona información para diseñar formulaciones novedosas con alta afinidad celular e internalización eficiente de antígenos, proporcionando una plataforma para el desarrollo de vacunas eficientes.
Introduction
Para combatir las enfermedades epidémicas, crónicas e infecciosas, es imperativo desarrollar adyuvantes efectivos para las vacunas profilácticas y terapéuticas 1,2. Idealmente, los adyuvantes deben poseer una excelente seguridad y activación inmune 3,4,5. Se cree que la captación y el proceso efectivos de antígenos por las células presentadoras de antígeno (APC) son una etapa esencial en las cascadas de señalización aguas abajo y el inicio de la respuesta inmune 6,7,8. Por lo tanto, obtener una comprensión clara del mecanismo de interacción de las células inmunes con antígenos y diseñar adyuvantes para mejorar la internalización son estrategias eficientes para mejorar la eficiencia de las vacunas.
Las micro/nanopartículas con propiedades únicas han sido previamente investigadas como sistemas de liberación de antígenos para mediar la captación celular de antígenos y la interacción celular con patrones moleculares asociados a patógenos 9,10. Al entrar en contacto con las células, los sistemas de entrega comienzan a interactuar con la matriz extracelular y la membrana celular, lo que condujo a la internalización y las respuestas celulares posteriores11,12. Estudios previos han sacado a la luz que la internalización de las partículas tiene lugar a través de la adhesión membrana-partícula celular13, seguida de la deformación flexible de la membrana celular y la difusión del receptor a la membrana superficial14,15. En estas circunstancias, las propiedades del sistema de entrega dependen de la afinidad con los APC, que posteriormente afectan la cantidad de absorción16,17.
Para obtener información sobre el diseño del sistema de administración para mejorar la respuesta inmune, se han centrado amplios esfuerzos en la investigación de la relación entre las propiedades de las partículas y la absorción celular. El presente estudio surgió de la observación de que las micro/nanopartículas sólidas con diversas cargas, tamaños y formas a menudo se estudian bajo esta luz, mientras que el papel de la fluidez en la internalización de antígenos rara vez se investiga18,19. De hecho, durante la adhesión, las partículas blandas demostraron cambios dinámicos de curvatura y difusiones laterales para aumentar el área de contacto para interacciones multivalentes, que difícilmente pueden ser replicadas por las partículas sólidas20,21. Además, las membranas celulares son bicapas de fosfolípidos (esfingolípidos o colesterol) en el sitio de absorción, y las sustancias hidrofóbicas pueden alterar la entropía conformacional de los lípidos, reduciendo la cantidad de energía requerida para la absorción celular22,23. Por lo tanto, amplificar la movilidad y promover la hidrofobicidad del sistema de administración puede ser una estrategia efectiva para fortalecer la internalización del antígeno para mejorar la respuesta inmune.
La emulsión Pickering, estabilizada por partículas sólidas ensambladas en la interfaz entre dos líquidos inmiscibles, ha sido ampliamente utilizada en el campo biológico24,25. De hecho, las partículas agregantes en la interfaz aceite/agua determinan la formulación de estructuras multinivel, que promueven interacciones multinivel entre el sistema de administración y la celular, e inducen aún más propiedades fisicoquímicas multifuncionales en la administración de fármacos. Debido a su deformabilidad y movilidad lateral, se esperaba que las emulsiones de Pickering entraran en interacción celular multivalente con los inmunocitos y fueran reconocidas por las proteínas de membrana26. Además, como los núcleos de micelas aceitosas en las emulsiones Pickering no están completamente cubiertos con partículas sólidas, las emulsiones Pickering poseen espacios de diferentes tamaños entre las partículas en la interfaz aceite/agua, lo que causa una mayor hidrofobicidad. Por lo tanto, es crucial explorar la afinidad de las emulsiones de Pickering con los APC y elaborar la posterior internalización para desarrollar adyuvantes eficientes.
Basándonos en estas consideraciones, diseñamos una emulsión de Pickering estabilizada con nanopartículas (PNPE) de PLGA como un sistema de administración de vacunas de fluidez que también ayudó a obtener información valiosa sobre la afinidad del PNPE con los BMDC y la internalización celular. La adhesión en tiempo real de vesículas extracelulares biomiméticas (bEV; un reemplazo de BMDC) a PNPE se monitoreó a través de un método sin etiquetado utilizando una microbalanza de cristal de cuarzo con monitoreo de disipación (QCM-D). Después de la caracterización de la afinidad de PNPE con BMDC, se utilizó microscopía de barrido láser confocal (CLSM) para determinar la captación de antígenos. El resultado indicó la mayor afinidad de PNPE con BMDC y la internalización eficiente del antígeno. Anticipamos que el PNPE exhibiría una mayor afinidad con las APC, lo que puede estimular mejor la internalización de antígenos para mejorar las respuestas inmunes.
Protocol
Representative Results
Discussion
Desarrollamos una emulsión de aceite/agua estabilizada con nanopartículas de PLGA como un sistema de administración para mejorar la internalización de antígenos. El PNPE preparado poseía una superficie densamente empaquetada para soportar el lugar de aterrizaje y una suavidad y fluidez únicas para un potente contacto celular con la membrana celular inmune. Además, la interfaz aceite/agua ofrecía una carga de antígenos de alto contenido, y el PLGA anfifílico confería PNPE con alta estabilidad para el transport…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por el Proyecto apoyado por el Programa Nacional de Investigación y Desarrollo Clave de China (2021YFE020527, 2021YFC2302605, 2021YFC2300142), De 0 a 1 Proyecto de Innovación Original del Programa de Investigación Científica Básica de Frontera de la Academia China de Ciencias (ZDBS-LY-SLH040), la Fundación para Grupos de Investigación Innovadores de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (Subvención No. 21821005).
Materials
| AddVax | InvivoGen | Vac-adx-10 | |
| Cell Strainer | Biosharp | BS-70-CS | 70 μm |
| Confocal Laser Scanning Microscope (CLSM) | Nikon | A1 | |
| Cy3 NHS Ester | YEASEN | 40777ES03 | |
| DAPI Staining Solution | Beyotime | C1005 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 16000-044 | |
| FITC Phalloidin | Solarbio | CA1620 | |
| Mastersizer 2000 Particle Size Analyzer | Malvern | ||
| Micro BCA protein Assay Kit | Thermo Science | 23235 | |
| Membrane emulsification equipment | Zhongke Senhui Microsphere Technology | FM0201/500M | |
| Mini-Extruder | Avanti Polar Lipids, Inc | ||
| NANO ZS | Malvern | JSM-6700F | |
| Polycarbonate membranes | Avanti Polar Lipids, Inc | ||
| Poly (lactic-co-glycolic acid) (PLGA) | Sigma-Aldrich | 26780-50-7 | Mw 7,000-17,000 |
| Poly-L-lysine Solution | Solarbio | P2100 | |
| Poly (vinyl alcohol) (PVA) | Sigma-Aldrich | 9002-89-5 | |
| QSense Silicon dioxide sensor | Biolin Scientific | QSX 303 | Surface roughness < 1 nm RMS |
| Quartz Crystal Microbalance | Biosharp | Q-SENSE E4 | |
| RPMI Medium 1640 basic | Gibco | C22400500BT | L-Glutamine, 25 mM HEPES |
| Scanning Electron Microscopy (SEM) | JEOL | JSM-6700F | |
| Squalene | Sigma-Aldrich | 111-02-4 |
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