Zelluläre Affinität der partikelstabilisierten Emulsion zur Förderung der Antigeninternalisierung
Summary
Um effiziente Adjuvantien rational zu gestalten, haben wir die Poly-Milchsäure-Co-Glykolsäure-Nanopartikel-stabilisierte Pickering-Emulsion (PNPE) entwickelt. Das PNPE besaß eine einzigartige Weichheit und eine hydrophobe Schnittstelle für einen potenten zellulären Kontakt und bot eine Antigenladung mit hohem Gehalt, was die zelluläre Affinität des Abgabesystems zu Antigen-präsentierenden Zellen verbesserte und eine effiziente Internalisierung von Antigenen induzierte.
Abstract
Die zelluläre Affinität von Mikro-/Nanopartikeln ist die Voraussetzung für zelluläre Erkennung, zelluläre Aufnahme und Aktivierung, die für die Wirkstoffabgabe und Immunantwort unerlässlich sind. Die vorliegende Studie entstand aus der Beobachtung, dass die Auswirkungen von Ladung, Größe und Form fester Partikel auf die Zellaffinität normalerweise berücksichtigt werden, aber wir erkennen selten die wesentliche Rolle von Weichheit, dynamischem Umstrukturierungsphänomen und komplexer Grenzflächeninteraktion in der Zellaffinität. Hier entwickelten wir die Polymilch-Co-Glykolsäure (PLGA) nanopartikelstabilisierte Pickering-Emulsion (PNPE), die die Mängel starrer Formen überwand und die Flexibilität und Fließfähigkeit von Krankheitserregern simulierte. Es wurde eine Methode entwickelt, um die Affinität von PNPE zu Zelloberflächen zu testen und die anschließende Internalisierung durch Immunzellen zu erarbeiten. Die Affinität von PNPE zu biomimetischen extrazellulären Vesikeln (bEVs) – dem Ersatz für dendritische Knochenmarkzellen (BMDCs) – wurde unter Verwendung einer Quarzkristallmikrowaage mit Dissipationsüberwachung (QCM-D) bestimmt, die eine Echtzeitüberwachung der Zellemulsionsadhäsion ermöglichte. Anschließend wurde das PNPE verwendet, um das Antigen (Ovalbumin, OVA) zu verabreichen, und die Aufnahme der Antigene durch BMDCs wurde mit konfokalem Laser-Scanning-Mikroskop (CLSM) beobachtet. Repräsentative Ergebnisse zeigten, dass die PNPE sofort die Frequenz (ΔF) verringerte, wenn sie auf die bEVs traf, was auf eine schnelle Adhäsion und eine hohe Affinität der PNPE zu den BMDCs hindeutet. PNPE zeigte eine signifikant stärkere Bindung an die Zellmembran als PLGA-Mikropartikel (PMPs) und AddaVax-Adjuvans (bezeichnet als tensidstabilisierte Nanoemulsion [SSE]). Darüber hinaus wurde aufgrund der erhöhten zellulären Affinität zu den Immunzyten durch dynamische Krümmungsänderungen und laterale Diffusionen die Antigenaufnahme im Vergleich zu PMPs und SSE gesteigert. Dieses Protokoll liefert Erkenntnisse für die Entwicklung neuartiger Formulierungen mit hoher Zellaffinität und effizienter Antigeninternalisierung und bietet eine Plattform für die Entwicklung effizienter Impfstoffe.
Introduction
Zur Bekämpfung epidemischer, chronischer und infektiöser Krankheiten ist es unerlässlich, wirksame Adjuvantien für prophylaktische und therapeutische Impfungen zu entwickeln 1,2. Idealerweise sollten die Adjuvantien eine ausgezeichnete Sicherheit und Immunaktivierungbesitzen 3,4,5. Es wird angenommen, dass die effektive Aufnahme und Verarbeitung von Antigenen durch Antigen-präsentierende Zellen (APCs) ein wesentliches Stadium in den nachgeschalteten Signalkaskaden und der Initiierung der Immunantwortist 6,7,8. Daher sind ein klares Verständnis des Mechanismus der Interaktion von Immunzellen mit Antigenen und die Entwicklung von Adjuvantien zur Verbesserung der Internalisierung effiziente Strategien, um die Effizienz von Impfstoffen zu verbessern.
Mikro-/Nanopartikel mit einzigartigen Eigenschaften wurden zuvor als Antigenabgabesysteme untersucht, um die zelluläre Aufnahme von Antigenen und die zelluläre Interaktion mit pathogenassoziierten molekularen Mustern zu vermitteln 9,10. Bei Kontakt mit Zellen beginnen Abgabesysteme mit der extrazellulären Matrix und Zellmembran zu interagieren, was zur Internalisierung und nachfolgenden zellulären Reaktionen führte11,12. Frühere Studien haben ans Licht gebracht, dass die Internalisierung von Partikeln durch Zellmembran-Partikel-Adhäsion13 erfolgt, gefolgt von flexibler Verformung der Zellmembran und Diffusion des Rezeptors zur Oberflächenmembran14,15. Unter diesen Umständen hängen die Eigenschaften des Verabreichungssystems von der Affinität zu APCs ab, die sich anschließend auf die Aufnahmemenge16,17 auswirken.
Um Erkenntnisse über das Design des Abgabesystems für eine verbesserte Immunantwort zu gewinnen, wurden umfangreiche Anstrengungen unternommen, um den Zusammenhang zwischen den Eigenschaften von Partikeln und der zellulären Aufnahme zu untersuchen. Die vorliegende Studie entstand aus der Beobachtung, dass feste Mikro-/Nanopartikel mit unterschiedlichen Ladungen, Größen und Formen oft in diesem Licht untersucht werden, während die Rolle der Fluidität bei der Antigeninternalisierung selten untersucht wird18,19. Tatsächlich zeigten die weichen Partikel während der Adhäsion dynamische Krümmungsänderungen und laterale Diffusionen, um die Kontaktfläche für multivalente Wechselwirkungen zu vergrößern, die von den festen Partikeln kaum repliziert werden können20,21. Darüber hinaus sind Zellmembranen Phospholipiddoppelschichten (Sphingolipide oder Cholesterin) an der Aufnahmestelle, und hydrophobe Substanzen können die Konformationsentropie von Lipiden verändern und die für die zelluläre Aufnahme erforderliche Energiemenge verringern22,23. Daher kann die Verstärkung der Mobilität und die Förderung der Hydrophobie des Abgabesystems eine wirksame Strategie zur Stärkung der Antigeninternalisierung sein, um die Immunantwort zu verbessern.
Pickering-Emulsion, stabilisiert durch feste Partikel, die an der Grenzfläche zwischen zwei nicht mischbaren Flüssigkeiten angeordnet sind, sind im biologischen Bereich weit verbreitet24,25. Tatsächlich bestimmen die aggregierenden Partikel an der Öl-Wasser-Grenzfläche die Formulierung von mehrstufigen Strukturen, die mehrstufige Verabreichungssystem-zelluläre Interaktionen fördern und weitere multifunktionale physikalisch-chemische Eigenschaften bei der Wirkstoffabgabe induzieren. Aufgrund ihrer Verformbarkeit und lateralen Beweglichkeit wurde erwartet, dass Pickering-Emulsionen in multivalente zelluläre Interaktion mit den Immunzyten eintreten und von den Membranproteinen26 erkannt werden. Da ölige Mizellenkerne in Pickering-Emulsionen nicht vollständig mit festen Partikeln bedeckt sind, besitzen Pickering-Emulsionen unterschiedlich große Lücken zwischen Partikeln an der Öl-Wasser-Grenzfläche, die eine höhere Hydrophobie verursachen. Daher ist es entscheidend, die Affinität von Pickering-Emulsionen zu APCs zu untersuchen und die anschließende Internalisierung zu erarbeiten, um effiziente Adjuvantien zu entwickeln.
Basierend auf diesen Überlegungen entwickelten wir eine PLGA-nanopartikelstabilisierte Pickering-Emulsion (PNPE) als Fluiditäts-Impfstoffverabreichungssystem, das auch dazu beitrug, wertvolle Erkenntnisse über die Affinität des PNPE zu BMDCs und die zelluläre Internalisierung zu gewinnen. Die Echtzeit-Adhäsion von biomimetischen extrazellulären Vesikeln (bEVs; ein Ersatz von BMDCs) an PNPE wurde über eine markierungsfreie Methode unter Verwendung einer Quarzkristallmikrowaage mit Dissipationsüberwachung (QCM-D) überwacht. Nach der Charakterisierung der Affinität von PNPE zu BMDCs wurde die konfokale Laserscanning-Mikroskopie (CLSM) verwendet, um die Antigenaufnahme zu bestimmen. Das Ergebnis zeigte die höhere Affinität von PNPE zu BMDCs und die effiziente Internalisierung des Antigens. Wir erwarteten, dass die PNPE eine höhere Affinität zu APCs aufweisen würde, was die Internalisierung von Antigenen besser stimulieren könnte, um die Immunantwort zu verstärken.
Protocol
Representative Results
Discussion
Wir haben die PLGA-Nanopartikel-stabilisierte Öl/Wasser-Emulsion als Abgabesystem für eine verbesserte Antigeninternalisierung entwickelt. Das präparierte PNPE besaß eine dicht gepackte Oberfläche, um den Landeplatz zu unterstützen, und eine einzigartige Weichheit und Fließfähigkeit für einen starken zellulären Kontakt mit der Immunzellmembran. Darüber hinaus bot die Öl/Wasser-Schnittstelle eine hochgradige Antigenbeladung, und amphiphiles PLGA verlieh PNPE eine hohe Stabilität für den Transport von Antigen…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde unterstützt durch ein Projekt, das vom National Key Research and Development Program of China (2021YFE020527, 2021YFC2302605, 2021YFC2300142), From 0 to 1 Original Innovation Project of Basic Frontier Scientific Research Program of Chinese Academy of Sciences (ZDBS-LY-SLH040), der Foundation for Innovative Research Groups der National Natural Science Foundation of China (Grant No. 21821005), unterstützt wurde.
Materials
| AddVax | InvivoGen | Vac-adx-10 | |
| Cell Strainer | Biosharp | BS-70-CS | 70 μm |
| Confocal Laser Scanning Microscope (CLSM) | Nikon | A1 | |
| Cy3 NHS Ester | YEASEN | 40777ES03 | |
| DAPI Staining Solution | Beyotime | C1005 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 16000-044 | |
| FITC Phalloidin | Solarbio | CA1620 | |
| Mastersizer 2000 Particle Size Analyzer | Malvern | ||
| Micro BCA protein Assay Kit | Thermo Science | 23235 | |
| Membrane emulsification equipment | Zhongke Senhui Microsphere Technology | FM0201/500M | |
| Mini-Extruder | Avanti Polar Lipids, Inc | ||
| NANO ZS | Malvern | JSM-6700F | |
| Polycarbonate membranes | Avanti Polar Lipids, Inc | ||
| Poly (lactic-co-glycolic acid) (PLGA) | Sigma-Aldrich | 26780-50-7 | Mw 7,000-17,000 |
| Poly-L-lysine Solution | Solarbio | P2100 | |
| Poly (vinyl alcohol) (PVA) | Sigma-Aldrich | 9002-89-5 | |
| QSense Silicon dioxide sensor | Biolin Scientific | QSX 303 | Surface roughness < 1 nm RMS |
| Quartz Crystal Microbalance | Biosharp | Q-SENSE E4 | |
| RPMI Medium 1640 basic | Gibco | C22400500BT | L-Glutamine, 25 mM HEPES |
| Scanning Electron Microscopy (SEM) | JEOL | JSM-6700F | |
| Squalene | Sigma-Aldrich | 111-02-4 |
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