Cellulær affinitet av partikkelstabilisert emulsjon for å øke antigen internalisering
Summary
For å rasjonelt designe effektive adjuvanser utviklet vi poly-melkesyre-koglykolsyre nanopartikkelstabilisert Pickering-emulsjon (PNPE). PNPE hadde unik mykhet og et hydrofobt grensesnitt for potent cellulær kontakt og tilbød antigenbelastning med høyt innhold, forbedret leveringssystemets cellulære affinitet til antigenpresenterende celler og induserte effektiv internalisering av antigener.
Abstract
Den cellulære affiniteten til mikro-/nanopartikler er forutsetningen for cellulær gjenkjenning, cellulært opptak og aktivering, som er avgjørende for legemiddellevering og immunrespons. Denne studien stammer fra observasjonen at effekten av ladning, størrelse og form av faste partikler på celleaffinitet vanligvis vurderes, men vi innser sjelden den essensielle rollen som mykhet, dynamisk restruktureringsfenomen og kompleks grensesnittinteraksjon i cellulær affinitet. Her utviklet vi poly-laktisk-koglykolsyre (PLGA) nanopartikkelstabilisert Pickering-emulsjon (PNPE) som overvant manglene i stive former og simulerte fleksibiliteten og fluiditeten til patogener. En metode ble satt opp for å teste PNPEs affinitet til celleoverflater og utdype den påfølgende internaliseringen av immunceller. PNPEs affinitet til bio-mimetiske ekstracellulære vesikler (bEV) – erstatningen for benmargs dendrittiske celler (BMDC) – ble bestemt ved bruk av en kvartskrystallmikrobalanse med spredningsovervåking (QCM-D), som tillot sanntidsovervåking av celleemulsjonsadhesjon. Deretter ble PNPE brukt til å levere antigenet (ovalbumin, OVA) og opptaket av antigenene av BMDC ble observert ved bruk av konfokal laserskanningsmikroskop (CLSM). Representative resultater viste at PNPE umiddelbart reduserte frekvensen (ΔF) når den møtte bEVs, noe som indikerer rask vedheft og høy affinitet av PNPE til BMDC. PNPE viste signifikant sterkere binding til cellemembranen enn PLGA-mikropartikler (PMPs) og AddaVax adjuvans (betegnet som overflateaktivt stabilisert nano-emulsjon [SSE]). Videre, på grunn av den forbedrede cellulære affiniteten til immuncyttene gjennom dynamiske krumningsendringer og laterale diffusjoner, ble antigenopptaket senere økt sammenlignet med PMP og SSE. Denne protokollen gir innsikt for å designe nye formuleringer med høy celleaffinitet og effektiv antigen-internalisering, og gir en plattform for utvikling av effektive vaksiner.
Introduction
For å bekjempe epidemiske, kroniske og smittsomme sykdommer er det viktig å utvikle effektive hjelpestoffer for profylaktiske og terapeutiske vaksinasjoner 1,2. Ideelt sett bør adjuvansene ha utmerket sikkerhet og immunaktivering 3,4,5. Effektivt opptak og prosess av antigener av antigenpresenterende celler (APC) antas å være et viktig stadium i nedstrøms signalkaskader og initiering av immunresponsen 6,7,8. Derfor, å få en klar forståelse av mekanismen for interaksjon av immunceller med antigener og designe adjuvanser for å forbedre internalisering, er effektive strategier for å øke effektiviteten av vaksiner.
Mikro-/nanopartikler med unike egenskaper har tidligere blitt undersøkt som antigenleveringssystemer for å formidle det cellulære opptaket av antigener og den cellulære interaksjonen med patogenassosierte molekylmønstre 9,10. Ved kontakt med celler begynner leveringssystemer å samhandle med den ekstracellulære matrisen og cellemembranen, noe som førte til internalisering og påfølgende cellulære responser11,12. Tidligere studier har brakt frem at internalisering av partikler skjer gjennom cellemembran-partikkeladhesjon13, etterfulgt av fleksibel deformasjon av cellemembranen og diffusjon av reseptoren til overflatemembranen14,15. Under disse omstendighetene avhenger egenskapene til leveringssystemet av affiniteten til APC-er, som senere påvirker opptaksmengden16,17.
For å få innsikt i utformingen av leveringssystemet for forbedret immunrespons, har det vært fokusert på undersøkelse av forholdet mellom egenskapene til partikler og cellulært opptak. Den foreliggende studien stammer fra observasjonen at faste mikro- / nanopartikler med forskjellige ladninger, størrelser og former ofte studeres i dette lyset, mens fluiditetens rolle i antigen internalisering sjelden undersøkes18,19. Faktisk, under vedheft, viste de myke partiklene dynamiske krumningsendringer og laterale diffusjoner for å øke kontaktområdet for multivalente interaksjoner, som knapt kan replikeres av de faste partiklene20,21. I tillegg er cellemembraner fosfolipid dobbeltlag (sfingolipider eller kolesterol) på opptaksstedet, og hydrofobe stoffer kan endre konformasjonsentropien av lipider, noe som reduserer mengden energi som kreves for cellulært opptak22,23. Dermed kan forsterkning av mobilitet og fremme hydrofobisitet av leveringssystemet være en effektiv strategi for å styrke antigen internalisering for å forbedre immunresponsen.
Pickering-emulsjon, stabilisert av faste partikler samlet ved grensesnittet mellom to ublandbare væsker, har blitt mye brukt i det biologiske feltet24,25. Faktisk bestemmer de aggregerende partiklene på olje / vann-grensesnittet formuleringen av flernivåstrukturer, som fremmer multi-level delivery system-cellulære interaksjoner, og induserer videre multifunksjonelle fysiokjemiske egenskaper i legemiddellevering. På grunn av deres deformabilitet og laterale mobilitet ble Pickering-emulsjoner forventet å gå inn i multivalent cellulær interaksjon med immunocyttene og bli anerkjent av membranproteinene26. I tillegg, da oljeaktige micellekjerner i Pickering-emulsjoner ikke er helt dekket med faste partikler, har Pickering-emulsjoner hull av forskjellige størrelser mellom partikler på olje / vann-grensesnittet, noe som forårsaker høyere hydrofobisitet. Dermed er det avgjørende å utforske affiniteten til Pickering-emulsjoner til APC-er og utdype den påfølgende internaliseringen for å utvikle effektive adjuvanser.
Basert på disse vurderingene konstruerte vi en PLGA nanopartikkelstabilisert Pickering-emulsjon (PNPE) som et fluiditetsvaksineleveringssystem som også bidro til å få verdifull innsikt i PNPEs affinitet til BMDC-er og cellulær internalisering. Real-time adhesjon av bio-mimetiske ekstracellulære vesikler (bEVs; en erstatning av BMDC) til PNPE ble overvåket via en etikettfri metode ved bruk av en kvartskrystallmikrobalanse med spredningsovervåking (QCM-D). Etter karakterisering av PNPEs affinitet til BMDC ble konfokal laserskanningsmikroskopi (CLSM) brukt til å bestemme antigenopptaket. Resultatet indikerte PNPEs høyere affinitet til BMDC, og effektiv internalisering av antigenet. Vi forventet at PNPE ville vise høyere affinitet til APC, noe som bedre kan stimulere internaliseringen av antigener for å forbedre immunresponsene.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vi utviklet PLGA nanopartikkelstabilisert olje / vannemulsjon som et leveringssystem for forbedret antigen internalisering. Den forberedte PNPE hadde en tettpakket overflate for å støtte landingsstedet og unik mykhet og fluiditet for potent cellulær kontakt med immuncellemembranen. Videre tilbød olje/vann-grensesnittet antigenbelastning med høyt innhold, og amfifil PLGA ga PNPE med høy stabilitet for transport av antigener til immunceller. PNPE kan raskt feste seg til overflaten av cellene, noe som indikerer at PLG…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av Project støttet av National Key Research and Development Program of China (2021YFE020527, 2021YFC2302605, 2021YFC2300142), From 0 to 1 Original Innovation Project of Basic Frontier Scientific Research Program of Chinese Academy of Sciences (ZDBS-LY-SLH040), Foundation for Innovative Research Groups of the National Natural Science Foundation of China (Grant No. 21821005).
Materials
| AddVax | InvivoGen | Vac-adx-10 | |
| Cell Strainer | Biosharp | BS-70-CS | 70 μm |
| Confocal Laser Scanning Microscope (CLSM) | Nikon | A1 | |
| Cy3 NHS Ester | YEASEN | 40777ES03 | |
| DAPI Staining Solution | Beyotime | C1005 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 16000-044 | |
| FITC Phalloidin | Solarbio | CA1620 | |
| Mastersizer 2000 Particle Size Analyzer | Malvern | ||
| Micro BCA protein Assay Kit | Thermo Science | 23235 | |
| Membrane emulsification equipment | Zhongke Senhui Microsphere Technology | FM0201/500M | |
| Mini-Extruder | Avanti Polar Lipids, Inc | ||
| NANO ZS | Malvern | JSM-6700F | |
| Polycarbonate membranes | Avanti Polar Lipids, Inc | ||
| Poly (lactic-co-glycolic acid) (PLGA) | Sigma-Aldrich | 26780-50-7 | Mw 7,000-17,000 |
| Poly-L-lysine Solution | Solarbio | P2100 | |
| Poly (vinyl alcohol) (PVA) | Sigma-Aldrich | 9002-89-5 | |
| QSense Silicon dioxide sensor | Biolin Scientific | QSX 303 | Surface roughness < 1 nm RMS |
| Quartz Crystal Microbalance | Biosharp | Q-SENSE E4 | |
| RPMI Medium 1640 basic | Gibco | C22400500BT | L-Glutamine, 25 mM HEPES |
| Scanning Electron Microscopy (SEM) | JEOL | JSM-6700F | |
| Squalene | Sigma-Aldrich | 111-02-4 |
References
- Ma, G., Gu, Z., Wei, W. Advanced vaccine delivery. Advanced Drug Delivery Reviews. 183, 114170 (2022).
- Sharma, J., Carson, C. S., Douglas, T., Wilson, J. T., Joyce, S. Nano-particulate platforms for vaccine delivery to enhance antigen-specific cd8(+) t-cell response. Methods in Molecular Biology. 2412, 367-398 (2022).
- Nguyen, T. P., et al. Safety and immunogenicity of nanocovax, a sars-cov-2 recombinant spike protein vaccine: interim results of a double-blind, randomised controlled phase 1 and 2 trial. The Lancet Regional Health. Western Pacific. 24, 100474 (2022).
- Coates, E. E., et al. Safety and immunogenicity of a trivalent virus-like particle vaccine against western, eastern, and venezuelan equine encephalitis viruses: a phase 1, open-label, dose-escalation, randomised clinical trial. The Lancet Infectious Diseases. 22 (8), 1210-1220 (2022).
- Wei, L., et al. Efficacy and safety of a nanoparticle therapeutic vaccine in patients with chronic hepatitis b: a randomized clinical trial. Hepatology. 75 (1), 182-195 (2022).
- Krishnan, R., Kim, J. O., Qadiri, S. S. N., Kim, J. O., Oh, M. J. Early viral uptake and host-associated immune response in the tissues of seven-band grouper following a bath challenge with nervous necrosis virus. Fish & Shellfish Immunology. 103, 454-463 (2020).
- Mishra, D., Mishra, P. K., Dubey, V., Dabadghao, S., Jain, N. K. Evaluation of uptake and generation of immune response by murine dendritic cells pulsed with hepatitis b surface antigen-loaded elastic liposomes. Vaccine. 25 (39-40), 6939-6944 (2007).
- Harwood, L. J., Gerber, H., Sobrino, F., Summerfield, A., Mccullough, K. C. Dendritic cell internalization of foot-and-mouth disease virus: influence of heparan sulfate binding on virus uptake and induction of the immune response. Journal of Virology. 82 (13), 6379-6394 (2008).
- Jing, H., et al. Fluorescent artificial antigens revealed extended membrane networks utilized by live dendritic cells for antigen uptake. Nano Letters. 22 (10), 4020-4027 (2022).
- Meena, J., Goswami, D. G., Anish, C., Panda, A. K. Cellular uptake of polylactide particles induces size dependent cytoskeletal remodeling in antigen presenting cells. Biomaterials Science. 9 (23), 7962-7976 (2021).
- Yang, J., et al. Drug delivery via cell membrane fusion using lipopeptide modified liposomes. ACS Central Science. 2 (9), 621-630 (2016).
- Rawle, R., Kasson, P., Boxer, S. Disentangling viral membrane fusion from receptor binding by using synthetic dna-lipid conjugates totether influenza virus to model lipid membranes. Biophysical Journal. 111 (1), 123-131 (2016).
- Ha, H. K., Kim, J. W., Lee, M. R., Jun, W., Lee, W. J. Cellular uptake and cytotoxicity of β-lactoglobulin nanoparticles: the effects of particle size and surface charge. Asian-Australasian Journal of Animal Sciences. 28 (3), 420-427 (2015).
- Malara, A., et al. Extracellular matrix structure and nano-mechanics determine megakaryocyte function. Blood. 118 (16), 4449-4453 (2011).
- Dankovich, T. M., et al. Extracellular matrix remodeling through endocytosis and resurfacing of tenascin-r. Nature Communications. 12 (1), 7129 (2021).
- Evans, E., Buxbaum, K. Affinity of red-blood-cell membrane for particle surfaces measured by the extent of particle encapsulation. Biophysical Journal. 34 (1), 1-12 (1981).
- Rohner, N. A., Purdue, L. N., Von Recum, H. A. Affinity-based polymers provide long-term immunotherapeutic drug delivery across particle size ranges optimal for macrophage targeting. Journal of Pharmaceutical Sciences. 110 (4), 1693-1700 (2021).
- Zhou, X., Liu, Y., Wang, X. F., Li, X. M., Xiao, B. Effect of particle size on the cellular uptake and anti-inflammatory activity of oral nanotherapeutics. Colloids and Surfaces B-Biointerfaces. 187, 110880 (2020).
- Zhang, D., et al. The morphology and surface charge-dependent cellular uptake efficiency of upconversion nanostructures revealed by single-particle optical microscopy. Chemical Science. 13 (12), 3610 (2022).
- Xi, Y. K., et al. Co2-responsive pickering emulsions stabilized by soft protein particles for interfacial biocatalysis. Chemical Science. 13 (10), 2884-2890 (2022).
- Trivedi, R. P., Klevets, I. I., Senyuk, B., Lee, T., Smalyukh, I. I. Reconfigurable interactions and three-dimensional patterning of colloidal particles and defects in lamellar soft media. Proceedings of the National Academy of Sciences of United States of America. 109 (13), 4744-4749 (2012).
- De Araujo, A. D., Hoang, H. N., Lim, J., Mak, J. Y. W., Fairlie, D. P. Tuning electrostatic and hydrophobic surfaces of aromatic rings to enhance membrane association and cell uptake of peptides. Angewandte Chemie. 61 (29), 03995 (2022).
- Waku, T., et al. Effect of the hydrophilic-hydrophobic balance of antigen-loaded peptide nanofibers on their cellular uptake, cellular toxicity, and immune stimulatory properties. International Journal of Molecular Sciences. 20 (15), 3781 (2019).
- Meng, X., et al. A soft pickering emulsifier made from chitosan and peptides endows stimuli-responsiveness, bioactivity and biocompatibility to emulsion. Carbohydrate Polymers. 277, 118768 (2022).
- Wang, Z., et al. Fabrication and in vitro/vivo evaluation of drug nanocrystals self-stabilized pickering emulsion for oral delivery of quercetin. Pharmaceutics. 14 (5), 897 (2022).
- Ji, J., et al. Core-shell-structured silica/polyacrylate particles prepared by pickering emulsion: influence of the nucleation model on particle interfacial organization and emulsion stability. Nanoscale Research Letters. 9 (1), 534 (2014).
- Chen, l., et al. Quantitative evaluation of proteins with bicinchoninic acid (bca): resonance raman and surface-enhanced resonance raman scattering-based methods. Analyst. 137 (24), 5834-5838 (2012).
- Colino, J., Shen, Y., Snapper, C. M. Dendritic cells pulsed with intact streptococcus pneumoniae elicit both protein- and polysaccharide-specific immunoglobulin isotype responses in vivo through distinct mechanisms. The Journal of Experimental Medicine. 195 (1), 1-13 (2002).
- Zhang, Y., Wu, J., Zhang, H., Wei, J., Wu, J. Extracellular vesicles-mimetic encapsulation improves oncolytic viro-immunotherapy in tumors with low coxsackie and adenovirus receptor. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 574007 (2020).
- Cappellano, G., Abreu, H., Casale, C., Dianzani, U., Chiocchetti, A. Nano-microparticle platforms in developing next-generation vaccines. Vaccines. 9 (6), 606 (2021).
- McClelland, R. D., Culp, T. N., Marchant, D. J. Imaging flow cytometry and confocal immunofluorescence microscopy of virus-host cell interactions. Frontiers in Cellular Infection Microbiology. 11, 749039 (2021).
- Konry, T., Sarkar, S., Sabhachandani, P., Cohen, N. Innovative tools and technology for analysis of single cells and cell-cell interaction. Annual Reviews of Biomedical Engineering. 18 (1), 259-284 (2016).
- D’Aurelio, R., et al. A comparison of EIS and QCM nanoMIP-based sensors for morphine. Nanomaterials. 11 (12), 3360 (2021).
- Li, Y. J., et al. Artificial exosomes for translational nanomedicine. Journal of Nanobiotechnology. 19 (1), 242 (2021).
- Rydell, G. E., Dahlin, A. B., Hook, F., Larson, G. QCM-D studies of human norovirus VLPs binding to glycosphingolipids in supported lipid bilayers reveal strain-specific characteristics. Glycobiology. 19 (11), 1176-1184 (2009).
