For rationelt at designe effektive adjuvanser udviklede vi poly-mælkesyre-co-glykolsyre-nanopartikelstabiliseret Pickering-emulsion (PNPE). PNPE havde unik blødhed og en hydrofob grænseflade til potent cellulær kontakt og tilbød antigenbelastning med højt indhold, hvilket forbedrede leveringssystemets cellulære affinitet til antigenpræsenterende celler og inducerede effektiv internalisering af antigener.
Den cellulære affinitet af mikro- / nanopartikler er forudsætningen for cellulær genkendelse, cellulær optagelse og aktivering, som er afgørende for lægemiddelafgivelse og immunrespons. Den nuværende undersøgelse stammer fra den observation, at virkningerne af ladning, størrelse og form af faste partikler på celleaffinitet normalt overvejes, men vi indser sjældent den væsentlige rolle, som blødhed, dynamisk omstruktureringsfænomen og kompleks grænsefladeinteraktion spiller i cellulær affinitet. Her udviklede vi poly-mælkesyre-co-glycolsyre (PLGA) nanopartikelstabiliseret Pickering-emulsion (PNPE), der overvandt manglerne ved stive former og simulerede patogenernes fleksibilitet og fluiditet. En metode blev oprettet for at teste affiniteten af PNPE til celleoverflader og uddybe den efterfølgende internalisering af immunceller. Finiteten af PNPE til bio-mimetiske ekstracellulære vesikler (bEV’er) – erstatningen for knoglemarvsdendritiske celler (BMDC’er) – blev bestemt ved hjælp af en kvartskrystalmikrobalance med spredningsovervågning (QCM-D), som muliggjorde realtidsovervågning af celleemulsionsadhæsion. Efterfølgende blev PNPE brugt til at levere antigenet (ovalbumin, OVA), og optagelsen af antigenerne af BMDC’er blev observeret ved anvendelse af konfokal laserscanningsmikroskop (CLSM). Repræsentative resultater viste, at PNPE straks reducerede frekvensen (ΔF), når den stødte på bEV’erne, hvilket indikerer hurtig vedhæftning og høj affinitet af PNPE til BMDC’erne. PNPE viste signifikant stærkere binding til cellemembranen end PLGA-mikropartikler (PMP’er) og AddaVax-adjuvans (betegnet som overfladeaktivt stabiliseret nanoemulsion [SSE]). På grund af den forbedrede cellulære affinitet til immunocytterne gennem dynamiske krumningsændringer og laterale diffusioner blev antigenoptagelsen efterfølgende øget sammenlignet med PMP’er og SSE. Denne protokol giver indsigt i design af nye formuleringer med høj celleaffinitet og effektiv antigeninternalisering, hvilket giver en platform for udvikling af effektive vacciner.
For at bekæmpe epidemiske, kroniske og smitsomme sygdomme er det bydende nødvendigt at udvikle effektive adjuvanser til profylaktiske og terapeutiske vaccinationer 1,2. Ideelt set bør adjuvanserne have fremragende sikkerhed og immunaktivering 3,4,5. Effektiv optagelse og proces af antigener af antigenpræsenterende celler (APC’er) menes at være et væsentligt stadium i nedstrøms signalkaskader og initiering af immunresponset 6,7,8. Derfor er det effektive strategier til at forbedre effektiviteten af vacciner at få en klar forståelse af mekanismen for interaktion mellem immunceller og antigener og designe adjuvanser til at forbedre internaliseringen.
Mikro-/nanopartikler med unikke egenskaber er tidligere blevet undersøgt som antigenafgivelsessystemer til at formidle den cellulære optagelse af antigener og den cellulære interaktion med patogenassocierede molekylære mønstre 9,10. Ved kontakt med celler begynder leveringssystemer at interagere med den ekstracellulære matrix og cellemembran, hvilket førte til internalisering og efterfølgende cellulære reaktioner11,12. Tidligere undersøgelser har vist, at internalisering af partikler finder sted gennem cellemembran-partikeladhæsion13, efterfulgt af fleksibel deformation af cellemembranen og diffusion af receptoren til overflademembranen14,15. Under disse omstændigheder afhænger leveringssystemets egenskaber af tilhørsforholdet til APC, som efterfølgende påvirker optagelsesmængden16,17.
For at få indsigt i designet af leveringssystemet til forbedret immunrespons har omfattende bestræbelser været fokuseret på undersøgelsen af forholdet mellem partiklernes egenskaber og cellulær optagelse. Den foreliggende undersøgelse stammer fra den observation, at faste mikro-/nanopartikler med forskellige ladninger, størrelser og former ofte studeres i dette lys, mens fluiditetens rolle i antigeninternalisering sjældent undersøges18,19. Faktisk viste de bløde partikler under vedhæftning dynamiske krumningsændringer og laterale diffusioner for at øge kontaktområdet for multivalente interaktioner, som næppe kan replikeres af de faste partikler20,21. Derudover er cellemembraner phospholipid dobbeltlag (sphingolipider eller kolesterol) på optagelsesstedet, og hydrofobe stoffer kan ændre den konformationelle entropi af lipider, hvilket reducerer mængden af energi, der kræves til cellulær optagelse22,23. Således kan forstærkning af mobilitet og fremme af hydrofobicitet af leveringssystemet være en effektiv strategi til styrkelse af antigeninternalisering for at forbedre immunresponset.
Pickeringemulsion, stabiliseret af faste partikler samlet ved grænsefladen mellem to ublandbare væsker, er blevet anvendt i vid udstrækning i det biologiske felt24,25. Faktisk bestemmer de aggregerende partikler på olie/ vand-grænsefladen formuleringen af strukturer på flere niveauer, som fremmer multi-level leveringssystem-cellulære interaktioner og yderligere inducerer multifunktionelle fysiokemiske egenskaber i lægemiddelafgivelse. På grund af deres deformerbarhed og laterale mobilitet forventedes pickeringemulsioner at komme ind i multivalent cellulær interaktion med immunocytterne og blive genkendt af membranproteinerne26. Da olieholdige micellekerner i Pickering-emulsioner ikke er helt dækket af faste partikler, har Pickering-emulsioner desuden huller af forskellig størrelse mellem partikler på olie/vand-grænsefladen, hvilket forårsager højere hydrofobicitet. Det er således afgørende at undersøge affiniteten af Pickering-emulsioner til APC’er og uddybe den efterfølgende internalisering for at udvikle effektive adjuvanser.
Baseret på disse overvejelser konstruerede vi en PLGA nanopartikelstabiliseret Pickering-emulsion (PNPE) som et fluiditetsvaccineleveringssystem, der også hjalp med at få værdifuld indsigt i PNPE’s affinitet til BMDC’er og cellulær internalisering. Realtidsadhæsionen af bio-mimetiske ekstracellulære vesikler (bEV’er; en erstatning af BMDC’er) til PNPE blev overvåget via en etiketfri metode ved hjælp af en kvartskrystalmikrobalance med spredningsovervågning (QCM-D). Efter karakterisering af PNPE’s affinitet til BMDC’er blev konfokal laserscanningsmikroskopi (CLSM) brugt til at bestemme antigenoptagelsen. Resultatet indikerede den højere affinitet af PNPE til BMDC’er og den effektive internalisering af antigenet. Vi forventede, at PNPE ville udvise højere affinitet til APC’er, hvilket bedre kan stimulere internaliseringen af antigener for at forbedre immunresponserne.
Vi udviklede PLGA nanopartikelstabiliseret olie/vandemulsion som et leveringssystem til forbedret antigeninternalisering. Den forberedte PNPE havde en tæt pakket overflade til at understøtte landingsstedet og unik blødhed og fluiditet for potent cellulær kontakt med immuncellemembranen. Desuden tilbød olie/vand-grænsefladen antigenbelastning med højt indhold, og amfifil PLGA gav PNPE høj stabilitet til transport af antigener til immunceller. PNPE kunne hurtigt klæbe til overfladen af cellerne, hvilket indikerer,…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af projekt støttet af Kinas nationale nøgleforsknings- og udviklingsprogram (2021YFE020527, 2021YFC2302605, 2021YFC2300142), Fra 0 til 1 originalt innovationsprojekt af grundlæggende frontier videnskabeligt forskningsprogram for kinesisk videnskabsakademi (ZDBS-LY-SLH040), Stiftelsen for innovative forskningsgrupper fra National Natural Science Foundation of China (tilskud nr. 21821005).
AddVax | InvivoGen | Vac-adx-10 | |
Cell Strainer | Biosharp | BS-70-CS | 70 μm |
Confocal Laser Scanning Microscope (CLSM) | Nikon | A1 | |
Cy3 NHS Ester | YEASEN | 40777ES03 | |
DAPI Staining Solution | Beyotime | C1005 | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 16000-044 | |
FITC Phalloidin | Solarbio | CA1620 | |
Mastersizer 2000 Particle Size Analyzer | Malvern | ||
Micro BCA protein Assay Kit | Thermo Science | 23235 | |
Membrane emulsification equipment | Zhongke Senhui Microsphere Technology | FM0201/500M | |
Mini-Extruder | Avanti Polar Lipids, Inc | ||
NANO ZS | Malvern | JSM-6700F | |
Polycarbonate membranes | Avanti Polar Lipids, Inc | ||
Poly (lactic-co-glycolic acid) (PLGA) | Sigma-Aldrich | 26780-50-7 | Mw 7,000-17,000 |
Poly-L-lysine Solution | Solarbio | P2100 | |
Poly (vinyl alcohol) (PVA) | Sigma-Aldrich | 9002-89-5 | |
QSense Silicon dioxide sensor | Biolin Scientific | QSX 303 | Surface roughness < 1 nm RMS |
Quartz Crystal Microbalance | Biosharp | Q-SENSE E4 | |
RPMI Medium 1640 basic | Gibco | C22400500BT | L-Glutamine, 25 mM HEPES |
Scanning Electron Microscopy (SEM) | JEOL | JSM-6700F | |
Squalene | Sigma-Aldrich | 111-02-4 |