Faag-gemedieerde genetische manipulatie van de ziekte van Lyme Spirochete Borrelia burgdorferi

Summary

Het vermogen van bacteriofaag om DNA tussen bacteriële cellen te verplaatsen, maakt ze effectieve hulpmiddelen voor de genetische manipulatie van hun bacteriële gastheren. Hier wordt een methodologie gepresenteerd voor het induceren, herstellen en gebruiken van φBB-1, een bacteriofaag van Borrelia burgdorferi, om heterologe DNA te transduceren tussen verschillende stammen van de ziekte van Lyme spirocheet.

Abstract

Het introduceren van vreemd DNA in de spirocheet Borrelia burgdorferi is bijna uitsluitend bereikt door transformatie met behulp van elektroporatie. Dit proces heeft aanzienlijk lagere efficiënties in de ziekte van Lyme spirocheet in vergelijking met andere, beter gekarakteriseerde Gram-negatieve bacteriën. De mate van succes van transformatie is sterk afhankelijk van het hebben van geconcentreerde hoeveelheden hoogwaardig DNA uit specifieke achtergronden en is onderhevig aan significante variabiliteit tussen stammen. Alternatieve middelen voor het introduceren van vreemd DNA (d.w.z. shuttlevectoren, fluorescerende verslaggevers en antibioticaresistentiemarkers) in B. burgdorferi kunnen een belangrijke aanvulling zijn op het armamentarium van nuttige hulpmiddelen voor de genetische manipulatie van de ziekte van Lyme spirocheet. Bacteriofaag is goed erkend als natuurlijke mechanismen voor de beweging van DNA tussen bacteriën in een proces dat transductie wordt genoemd. In deze studie is een methode ontwikkeld voor het gebruik van de alomtegenwoordige borrelfaag φBB-1 om DNA te transduceren tussen B. burgdorferi-cellen van zowel dezelfde als verschillende genetische achtergronden. Het getransduceerde DNA omvat zowel borreliaal DNA als heterologe DNA in de vorm van kleine shuttlevectoren. Deze demonstratie suggereert een potentieel gebruik van faag-gemedieerde transductie als aanvulling op elektroporatie voor de genetische manipulatie van de ziekte van Lyme spirocheet. Dit rapport beschrijft methoden voor de inductie en zuivering van faag φBB-1 van B. burgdorferi, het gebruik van deze faag in transductietests en de selectie en screening van potentiële transductanten.

Introduction

De ontwikkeling van hulpmiddelen voor de genetische manipulatie van de spirochetale bacterie Borrelia burgdorferi heeft een onmetelijke waarde toegevoegd aan het begrip van de aard van de ziekte van Lyme 1,2,3,4. B. burgdorferi heeft een ongewoon complex genoom dat bestaat uit een klein lineair chromosoom en zowel lineaire als circulaire plasmiden ^5,6. Spontaan plasmideverlies, intragene herschikking (beweging van genen van het ene plasmide naar het andere binnen hetzelfde organisme) en horizontale genoverdracht (HGT, de beweging van DNA tussen twee organismen) hebben geleid tot een duizelingwekkende hoeveelheid genetische heterogeniteit bij B. burgdorferi (zie bijvoorbeeld Schutzer et ^al.7). De resulterende genotypen (of “stammen”) zijn allemaal leden van dezelfde soort, maar hebben genetische verschillen die hun vermogen om over te dragen op en infecteren van verschillende zoogdiergastheren^beïnvloeden 8,9,10,11. In dit rapport zal de term “stam” worden gebruikt om te verwijzen naar B. burgdorferi met een bepaalde natuurlijk afgeleide genetische achtergrond; de term “kloon” zal worden gebruikt om te verwijzen naar een stam die genetisch is gemodificeerd voor een bepaald doel of als gevolg van experimentele manipulatie.

De moleculaire toolbox die beschikbaar is voor gebruik in B. burgdorferi omvat selecteerbare markers, genreporters, shuttlevectoren, transposonmutagenese, induceerbare promotors en counter-selectable markers (voor een overzicht, zie Drektrah en Samuels¹²). Het effectieve gebruik van deze methodologieën vereist de kunstmatige introductie van heterologe (vreemde) DNA in een B. burgdorferi-belangenstam. In B. burgdorferi wordt de introductie van heterologe DNA bijna uitsluitend bereikt via elektroporatie, een methode die een puls elektriciteit gebruikt om een bacterieel membraan tijdelijk doorlaatbaar te maken voor kleine stukjes DNA die in de media worden geïntroduceerd¹. De meerderheid van de cellen (geschat op ≥99,5%) worden gedood door de pols, maar de resterende cellen hebben een hoge frequentie van het behoud van het heterologe DNA¹³. Hoewel beschouwd als een van de meest efficiënte methoden om DNA in bacteriën te introduceren, is de frequentie van elektroporatie in B. burgdorferi zeer laag (variërend van 1 transformator in 5 × 10⁴ tot 5 × 10⁶ cellen)¹³. De barrières voor het bereiken van hogere frequenties van transformatie lijken zowel technisch als biologisch te zijn. Technische barrières voor de succesvolle elektroporatie van B. burgdorferi omvatten zowel de hoeveelheid DNA (>10 μg) die nodig is als de vereiste dat de spirocheten zich in precies de juiste groeifase bevinden (mid-log, tussen 2 × 10⁷ cellen·ml⁻¹ en 7 × 10⁷ cellen·ml⁻¹) bij het bereiden van elektrocompetente cellen^12,13. Deze technische barrières kunnen echter gemakkelijker te overwinnen zijn dan de biologische barrières.

Onderzoekers van de ziekte van Lyme erkennen dat B. burgdorferi-klonen kunnen worden onderverdeeld in twee brede categorieën met betrekking tot hun vermogen om genetisch te worden gemanipuleerd^13,14. Hoge passage, lab-aangepaste isolaten worden vaak gemakkelijk getransformeerd, maar hebben meestal de plasmiden verloren die essentieel zijn voor infectiviteit, gedragen zich op een fysiologisch afwijkende manier en zijn niet in staat om een zoogdiergastheer te infecteren of te volharden in een tekenvector^12,13. Hoewel deze klonen nuttig zijn geweest voor het ontleden van de moleculaire biologie van de spirocheet binnen het laboratorium, zijn ze van weinig waarde voor het bestuderen van de spirocheet binnen de biologische context van de enzoötische cyclus. Infectieuze isolaten met een lage doorgang daarentegen gedragen zich op een fysiologische manier die een infectieuze toestand weerspiegelt en kunnen de infectiecyclus voltooien, maar zijn meestal recalcitrant voor de introductie van heterologe DNA en zijn daarom moeilijk te manipuleren voor onderzoek^12,13. De moeilijkheid bij het transformeren van isolaten met een lage doorgang houdt verband met ten minste twee verschillende factoren: (i) isolaten met een lage doorgang klonteren vaak strak samen, vooral onder de omstandigheden met hoge dichtheid die nodig zijn voor elektroporatie, waardoor veel cellen worden geblokkeerd voor de volledige toepassing van de elektrische lading of de toegang tot het DNA in de media^13,15; en (ii) B. burgdorferi codeert ten minste twee verschillende plasmide-borne restriction-modification (R-M) systemen die verloren kunnen gaan in high-passage isolaten^14,16. R-M-systemen zijn geëvolueerd om bacteriën in staat te stellen vreemd DNA te herkennen en^{te elimineren 17}. Inderdaad, verschillende studies in B. burgdorferi hebben aangetoond dat transformatie-efficiënties toenemen wanneer de bron van het DNA B. burgdorferi is in plaats van Escherichia coli^13,16. Helaas is het verkrijgen van de vereiste hoge concentratie DNA voor elektroporatie van B. burgdorferi een duur en tijdrovend vooruitzicht. Een andere mogelijke zorg bij het elektropoderen en selecteren van isolaten met een lage doorgang is dat het proces de voorkeur lijkt te geven aan transformatoren die het kritische virulentie-geassocieerde plasmide, lp25 14,18,19, hebben verloren; dus, de handeling van het genetisch manipuleren van low-passage B. burgdorferi isolaten via elektroporatie kan selecteren op klonen die niet geschikt zijn voor biologisch relevante analyse binnen de enzoötische cyclus²⁰. Gezien deze problemen zou een systeem waarin heterologe DNA kan worden geëlektrotransformeerd in B. burgdorferi-klonen met hoge passage en vervolgens kan worden overgebracht in infectieuze isolaten met een lage passage via een andere methode dan elektroporatie, een welkome aanvulling kunnen zijn op de groeiende verzameling moleculaire hulpmiddelen die beschikbaar zijn voor gebruik in de spirocheet van de ziekte van Lyme.

Naast transformatie (de opname van naakt DNA) zijn er nog twee andere mechanismen waarmee bacteriën regelmatig heterologe DNA opnemen: conjugatie, de uitwisseling van DNA tussen bacteriën in direct fysiek contact met elkaar, en transductie, wat de uitwisseling van DNA is gemedieerd door een bacteriofaag²¹. Inderdaad, het vermogen van bacteriofaag om HGT te bemiddelen is gebruikt als een experimenteel hulpmiddel voor het ontleden van de moleculaire processen binnen een aantal bacteriële systemen 22,23,24. B. burgdorferi is van nature niet bekwaam voor de opname van naakt DNA, en er is weinig bewijs dat B. burgdorferi codeert voor het apparaat dat nodig is om succesvolle conjugatie te bevorderen. Eerdere rapporten hebben echter de identificatie en voorlopige karakterisering beschreven van φBB-1, een gematigde bacteriofaag van B. burgdorferi 25,26,27,28. φBB-1 pakketten een familie van 30 kb plasmiden gevonden in B. burgdorferi²⁵; de leden van deze familie zijn aangewezen als cp32’s. Consistent met een rol voor φBB-1 bij deelname aan HGT onder B. burgdorferi-stammen, rapporteerden Stevenson et al. een identieke cp32 gevonden in twee stammen met anders ongelijksoortige cp32’s, wat een recente verdeling van deze cp32 tussen deze twee stammen suggereert, waarschijnlijk via transductie²⁹. Er zijn ook aanwijzingen voor significante recombinatie via HGT bij de cp32’s in een verder relatief stabiel genoom 30,31,32,33. Ten slotte is het vermogen van φBB-1 om zowel cp32’s als heterologous shuttle vector DNA te transduceren tussen cellen van dezelfde stam en tussen cellen van twee verschillende stammen eerder aangetoond^27,28. Gezien deze bevindingen is φBB-1 voorgesteld als een ander te ontwikkelen instrument voor de dissectie van de moleculaire biologie van B. burgdorferi.

Het doel van dit rapport is om een methode te beschrijven voor het induceren en zuiveren van faag φBB-1 van B. burgdorferi, evenals een protocol voor het uitvoeren van een transductietest tussen B. burgdorferi-klonen en het selecteren en screenen van potentiële transductanten.

Protocol

Alle experimenten met recombinant DNA en BSL-2 organismen werden beoordeeld en goedgekeurd door de Quinnipiac University Institutional Biosafety Committee. 1. Bereiding van de B. burgdorferi-cultuur voor de productie van φBB-1 Bereid Barbour-Stoenner-Kelly medium aangevuld met 6,6% warmte-geïnactiveerd normaal konijnenserum (BSK)15. Combineer voor 1 l 1x BSK de in tabel 1 vermelde componenten in 900 ml water, stel d…

Representative Results

Het gebruik van bacteriofaag om DNA te verplaatsen tussen gemakkelijker transformeerbare B. burgdorferi-stammen of klonen die recalcitrant zijn voor elektrotransformatie, vertegenwoordigt een ander hulpmiddel voor het voortdurende moleculaire onderzoek naar de determinanten van de ziekte van Lyme. De hierin beschreven transductietest kan indien nodig worden aangepast om de beweging van DNA tussen klonen van belang te vergemakkelijken met behulp van een of twee antibiotica voor de selectie van potentiële transdu…

Discussion

Het gebruik van transductie zou een methode kunnen zijn om ten minste enkele van de biologische en technische barrières in verband met de elektrotransformatie van B. burgdorferi 1,4,13,37 te overwinnen. In veel systemen kan bacteriofaag gastheer (niet-profaag) DNA tussen bacteriële cellen verplaatsen door gegeneraliseerde of gespecialiseerde transductie^</…

Materials

1 L filter units (PES, 0.22 µm pore size)	Millipore Sigma	S2GPU10RE
12 mm x 75 mm tube (dual position cap) (polypropylene)	USA Scientific	1450-0810	holds 4 mL with low void volume (for induction)
15 mL conical centrifuge tubes (polypropylene)	USA Scientific	5618-8271
1-methyl-3-nitroso-nitroguanidine (MNNG)	Millipore Sigma		CAUTION: potential carcinogen; no longer readily available, have not tested offered substitute
5.75" Pasteur Pipettes (cotton-plugged/borosilicate glass/non-sterile)	Thermo Fisher Scientific	13-678-8A	autoclave prior to use
50 mL conical centrifuge tubes (polypropylene)	USA Scientific	1500-1211
Absolute ethanol
Agarose LE	Dot Scientific inc.	AGLE-500
Bacto Neopeptone	Gibco	DF0119-17-9
Bacto TC Yeastolate	Gibco	255772
Bovine serum albumin (serum replacement grade)	Gemini Bio-Products	700-104P
Chloroform (for molecular biology)	Thermo Fisher Scientific	BP1145-1	CAUTION: volatile organic; use only in a chemical fume hood
CMRL-1066 w/o L-Glutamine (powder)	US Biological	C5900-01	cell culture grade
Erythromycin	Research Products International Corp	E57000-25.0
Gentamicin reagent solution	Gibco	15750-060
Glucose (Dextrose Anhydrous)	Thermo Fisher Scientific	BP350-500
HEPES	Thermo Fisher Scientific	BP310-500
Kanamycin sulfate	Thermo Fisher Scientific	25389-94-0
Millex-GS (0.22 µM pore size)	Millipore Sigma	SLGSM33SS	to filter sterilize antibiotics and other small volume solutions
Mitomycin C	Thermo Fisher Scientific	BP25312	CAUTION: potential carcinogen; use only in a chemical fume hood
N-acetyl-D-glucosamine	MP Biomedicals, LLC	100068
Oligonucleotides (primers for PCR)	IDT DNA
OmniPrep (total genomic extraction kit)	G Biosciences	786-136
Petri Dish (100 mm × 15 mm)	Thermo Fisher Scientific	FB0875712
Petroff-Hausser counting chamber	Hausser scientific	HS-3900
Petroff-Hausser counting chamber cover glass	Hausser scientific	HS-5051
Polyethylene glycol 8000 (PEG)	Thermo Fisher Scientific	BP233-1
Rabbit serum non-sterile trace-hemolyzed young (NRS)	Pel-Freez Biologicals	31119-3	heat inactivate as per manufacturer's instructions
Semi-micro UV transparent cuvettes	USA Scientific	9750-9150
Sodium bicarbonate	Thermo Fisher Scientific	BP328-500
Sodium chloride	Thermo Fisher Scientific	BP358-1
Sodium pyruvate	Millipore Sigma	P8674-25G
Spectronic Genesys 5	Thermo Fisher Scientific
Streptomycin sulfate solution	Millipore Sigma	S6501-50G
Trisodium citrate dihydrate	Millipore Sigma	S1804-500G	sodium citrate for BSK