Manipulation génétique médiée par phage du spirochète de la maladie de Lyme Borrelia burgdorferi

Summary

La capacité du bactériophage à déplacer l’ADN entre les cellules bactériennes en fait des outils efficaces pour la manipulation génétique de leurs hôtes bactériens. Présenté ici est une méthodologie pour induire, récupérer et utiliser φBB-1, un bactériophage de Borrelia burgdorferi, pour transduire l’ADN hétérologue entre différentes souches du spirochète de la maladie de Lyme.

Abstract

L’introduction d’ADN étranger dans le spirochète Borrelia burgdorferi a été presque exclusivement réalisée par transformation par électroporation. Ce processus a une efficacité nettement inférieure dans le spirochète de la maladie de Lyme par rapport à d’autres bactéries à Gram négatif mieux caractérisées. Le taux de réussite de la transformation dépend fortement de la concentration de quantités d’ADN de haute qualité provenant de milieux spécifiques et est sujet à une variabilité importante d’une souche à l’autre. D’autres moyens d’introduire de l’ADN étranger (c.-à-d. vecteurs navettes, rapporteurs fluorescents et marqueurs de résistance aux antibiotiques) dans B. burgdorferi pourraient constituer un ajout important à l’arsenal d’outils utiles pour la manipulation génétique du spirochète de la maladie de Lyme. Les bactériophages ont été bien reconnus comme des mécanismes naturels pour le mouvement de l’ADN entre les bactéries dans un processus appelé transduction. Dans cette étude, une méthode a été développée pour utiliser le phage borrélial omniprésent φBB-1 pour transduire l’ADN entre les cellules de B. burgdorferi de même fond génétique et de milieux génétiques différents. L’ADN transduit comprend à la fois de l’ADN borrélial et de l’ADN hétérologue sous forme de petits vecteurs navette. Cette démonstration suggère une utilisation potentielle de la transduction médiée par les phages comme complément à l’électroporation pour la manipulation génétique du spirochète de la maladie de Lyme. Ce rapport décrit les méthodes d’induction et de purification du phage φBB-1 de B. burgdorferi, l’utilisation de ce phage dans les essais de transduction, ainsi que la sélection et le criblage de transductants potentiels.

Introduction

Le développement d’outils pour la manipulation génétique de la bactérie spirochétale Borrelia burgdorferi a ajouté une valeur incommensurable à la compréhension de la nature de la maladie de Lyme 1,2,3,4. B. burgdorferi possède un génome exceptionnellement complexe composé d’un petit chromosome linéaire et de plasmides linéaires et circulaires ^5,6. La perte plasmidique spontanée, le réarrangement intragénique (mouvement des gènes d’un plasmide à un autre au sein d’u....

Protocol

Toutes les expériences utilisant de l’ADN recombinant et des organismes BSL-2 ont été examinées et approuvées par le comité institutionnel de biosécurité de l’Université Quinnipiac.

1. Préparation de la culture de B. burgdorferi pour la production de φBB-1

1. Préparer le milieu Barbour-Stoenner-Kelly complété par 6,6 % de sérum normal de lapin (BSK)¹⁵. Pour 1 L de 1x BSK, combiner les composants énumérés au tableau 1 dans 900 mL d’eau, ajuster le pH à 7,6 en utilisant 1 N d’hydroxyde de sodium et mélanger lentement à 4 °C pendant 2-4 h. Une fois le mélange terminé, vé....

Results

L’utilisation de bactériophages pour déplacer l’ADN entre des souches ou des clones de B. burgdorferi plus facilement transformables qui sont récalcitrants à l’électrotransformation représente un autre outil pour l’étude moléculaire continue des déterminants de la maladie de Lyme. Le test de transduction décrit ici peut être modifié au besoin pour faciliter le mouvement de l’ADN entre les clones d’intérêt en utilisant un ou deux antibiotiques pour la sélection de transducteurs potentiels. La transduction de l’AD.......

Discussion

L’utilisation de la transduction pourrait représenter une méthode pour surmonter au moins certaines des barrières biologiques et techniques associées à l’électrotransformation de B. burgdorferi 1,4,13,37. Dans de nombreux systèmes, le bactériophage peut déplacer l’ADN de l’hôte (non prophage) entre les cellules bactériennes par transduction généralisée ou spécialisée 22,23,24,49,50.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Unités de filtration de 1 L (PES, 0,22 & micro ; taille des pores)	Millipore Sigma	S2GPU10RE
tube de 12 mm x 75 mm (capuchon à double position) (polypropylène)	USA Scientific	1450-0810	contient 4 mL avec un faible volume de vide (pour l’induction)
Tubes à centrifuger coniques de 15 mL (polypropylène)	USA Scientific	5618-8271
1-méthyl-3-nitroso-nitroguanidine (MNNG)	Millipore Sigma		ATTENTION : cancérogène potentiel ; n’est plus facilement disponible, n’a pas testé proposé des
pipettes Pasteur de remplacement de 5,75 po (bouchées en coton/verre borosilicaté/non stériles)	Autoclave Thermo Fisher Scientific	13-678-8A	avant utilisation
Tubes à centrifuger coniques de 50 mL (polypropylène)	USA Scientific	1500-1211
Éthanol
Agarose LE	Dot Scientific inc.	AGLE-500
Bacto Neopeptone	Gibco	DF0119-17-9
Bacto TC Yeastolate	Gibco	255772
Albumine sérique bovine (grade de remplacement sérique)	Gemini Bio-Products	700-104P
Chloroforme (pour la biologie moléculaire)	Thermo Fisher Scientific	BP1145-1	ATTENTION : organique volatil ; à utiliser uniquement dans une hotte chimique
CMRL-1066 w/o L-Glutamine (poudre)	US Biological	C5900-01	qualité de culture cellulaire
Erythromycin	Research Products International Corp	E57000-25.0
Solution réactive de gentamicine	Gibco	15750-060
Glucose (dextrose anhydre)	Thermo Fisher Scientific	BP350-500
HEPES	Thermo Fisher Scientific	BP310-500
Sulfate de kanamycine	Thermo Fisher Scientific	25389-94-0
Millex-GS (0,22 & micro ; M taille des pores)	Millipore Sigma	SLGSM33SS	pour filtrer stériliser les antibiotiques et autres solutions de petit volume
Mitomycine C	Thermo Fisher Scientific	BP25312	ATTENTION : cancérogène potentiel ; à utiliser uniquement dans une hotte chimique
N-acétyl-D-glucosamine	MP Biomedicals, LLC	100068
Oligonucléotides (amorces pour PCR)	IDT DNA
OmniPrep (kit d’extraction génomique totale)	G Biosciences	786-136
Boîte de Pétri (100 mm & fois ; 15 mm)	Thermo Fisher Scientific	FB0875712
Chambre de comptage Petroff-Hausser	Hausser scientific	HS-3900
Chambre de comptage Petroff-Hausser verre de couverture Hausser	scientific	HS-5051
Polyéthylène glycol 8000 (PEG)	Thermo Fisher Scientific	BP233-1
Sérum de lapin non stérile à l’état de traces hémolysées jeunes (NRS)	Pel-Freez Biologicals	31119-3	inactivé par la chaleur selon les instructions du fabricant
Semi-micro UV transparentes Cuvettes transparentes	USA Scientific	9750-9150
Bicarbonate de sodium	Thermo Fisher Scientific	BP328-500
Chlorure de sodium	Thermo Fisher Scientific	BP358-1
Pyruvate de sodium	Millipore Sigma	P8674-25G
Spectronic Genesys 5	Thermo Fisher Scientific
Solution de sulfate de streptomycine	Millipore Sigma	S6501-50G
Citrate trisodique dihydraté	Millipore Sigma	S1804-500G	Citrate de sodium pour BSK