Summary

Manipulation génétique médiée par phage du spirochète de la maladie de Lyme Borrelia burgdorferi

Published: September 28, 2022
doi:

Summary

La capacité du bactériophage à déplacer l’ADN entre les cellules bactériennes en fait des outils efficaces pour la manipulation génétique de leurs hôtes bactériens. Présenté ici est une méthodologie pour induire, récupérer et utiliser φBB-1, un bactériophage de Borrelia burgdorferi, pour transduire l’ADN hétérologue entre différentes souches du spirochète de la maladie de Lyme.

Abstract

L’introduction d’ADN étranger dans le spirochète Borrelia burgdorferi a été presque exclusivement réalisée par transformation par électroporation. Ce processus a une efficacité nettement inférieure dans le spirochète de la maladie de Lyme par rapport à d’autres bactéries à Gram négatif mieux caractérisées. Le taux de réussite de la transformation dépend fortement de la concentration de quantités d’ADN de haute qualité provenant de milieux spécifiques et est sujet à une variabilité importante d’une souche à l’autre. D’autres moyens d’introduire de l’ADN étranger (c.-à-d. vecteurs navettes, rapporteurs fluorescents et marqueurs de résistance aux antibiotiques) dans B. burgdorferi pourraient constituer un ajout important à l’arsenal d’outils utiles pour la manipulation génétique du spirochète de la maladie de Lyme. Les bactériophages ont été bien reconnus comme des mécanismes naturels pour le mouvement de l’ADN entre les bactéries dans un processus appelé transduction. Dans cette étude, une méthode a été développée pour utiliser le phage borrélial omniprésent φBB-1 pour transduire l’ADN entre les cellules de B. burgdorferi de même fond génétique et de milieux génétiques différents. L’ADN transduit comprend à la fois de l’ADN borrélial et de l’ADN hétérologue sous forme de petits vecteurs navette. Cette démonstration suggère une utilisation potentielle de la transduction médiée par les phages comme complément à l’électroporation pour la manipulation génétique du spirochète de la maladie de Lyme. Ce rapport décrit les méthodes d’induction et de purification du phage φBB-1 de B. burgdorferi, l’utilisation de ce phage dans les essais de transduction, ainsi que la sélection et le criblage de transductants potentiels.

Introduction

Le développement d’outils pour la manipulation génétique de la bactérie spirochétale Borrelia burgdorferi a ajouté une valeur incommensurable à la compréhension de la nature de la maladie de Lyme 1,2,3,4. B. burgdorferi possède un génome exceptionnellement complexe composé d’un petit chromosome linéaire et de plasmides linéaires et circulaires 5,6. La perte plasmidique spontanée, le réarrangement intragénique (mouvement des gènes d’un plasmide à un autre au sein d’un même organisme) et le transfert horizontal de gènes (HGT, le mouvement de l’ADN entre deux organismes) ont donné lieu à une hétérogénéité génétique vertigineuse chez B. burgdorferi (pour un exemple, voir Schutzer et al.7). Les génotypes (ou « souches ») qui en résultent sont tous membres de la même espèce, mais présentent des différences génétiques qui influencent leur capacité à transmettre et à infecter différents mammifères hôtes 8,9,10,11. Dans le présent rapport, le terme « souche » sera utilisé pour désigner B. burgdorferi ayant un bagage génétique naturel particulier; Le terme « clone » sera utilisé pour désigner une souche qui a été génétiquement modifiée dans un but particulier ou à la suite d’une manipulation expérimentale.

La boîte à outils moléculaire disponible pour une utilisation chez B. burgdorferi comprend des marqueurs sélectionnables, des rapporteurs de gènes, des vecteurs navettes, une mutagénèse par transposon, des promoteurs inductibles et des marqueurs contre-sélectionnables (pour une revue, voir Drektrah et Samuels12). L’utilisation efficace de ces méthodologies nécessite l’introduction artificielle d’ADN hétérologue (étranger) dans une souche d’intérêt de B. burgdorferi. Chez B. burgdorferi, l’introduction de l’ADN hétérologue est réalisée presque exclusivement par électroporation, une méthode qui utilise une impulsion électrique pour rendre une membrane bactérienne transitoirement perméable à de petits morceaux d’ADN introduits dans le milieu1. La majorité des cellules (estimées à ≥99,5%) sont tuées par le pouls, mais les cellules restantes ont une fréquence élevée de rétention de l’ADN hétérologue13. Bien que considérée comme l’une des méthodes les plus efficaces pour introduire de l’ADN dans les bactéries, la fréquence d’électroporation dans B. burgdorferi est très faible (allant de 1 transformant sur 5 × 104 à 5 × 106 cellules)13. Les obstacles à l’obtention de fréquences de transformation plus élevées semblent être à la fois techniques et biologiques. Les obstacles techniques à une électroporation réussie de B. burgdorferi comprennent à la fois la quantité d’ADN (>10 μg) nécessaire et l’exigence que les spirochètes soient exactement dans la phase de croissance correcte (log moyen, entre 2 × 10 7 cellules·mL−1 et 7 × 107 cellules·mL−1) lors de la préparation de cellules électrocompétentes12,13. Ces obstacles techniques, cependant, peuvent être plus faciles à surmonter que les obstacles biologiques.

Les chercheurs sur la maladie de Lyme reconnaissent que les clones de B. burgdorferi peuvent être divisés en deux grandes catégories en ce qui concerne leur capacité à être manipulés génétiquement13,14. Les isolats à passage élevé adaptés au laboratoire sont souvent facilement transformés, mais ont généralement perdu les plasmides essentiels à l’infectiosité, se comportent de manière physiologiquement aberrante et ne sont pas capables d’infecter un hôte mammifère ou de persister dans un vecteurde tiques 12,13. Bien que ces clones aient été utiles pour disséquer la biologie moléculaire du spirochète en laboratoire, ils sont de peu de valeur pour étudier le spirochète dans le contexte biologique du cycle enzootique. Les isolats infectieux à faible passage, en revanche, se comportent d’une manière physiologique reflétant un état infectieux et peuvent compléter le cycle infectieux, mais sont généralement récalcitrants à l’introduction d’ADN hétérologue et sont, par conséquent, difficiles à manipuler pour l’étude12,13. La difficulté de transformer les isolats à faible passage est liée à au moins deux facteurs différents : (i) les isolats à faible passage s’agglutinent souvent étroitement, en particulier dans les conditions de haute densité requises pour l’électroporation, empêchant ainsi de nombreuses cellules d’appliquer pleinement la charge électrique ou d’accéder à l’ADN dans le milieu13,15; et ii) B. burgdorferi code pour au moins deux systèmes différents de restriction-modification (R-M) transmis par plasmide qui peuvent être perdus dans les isolats à passage élevé14,16. Les systèmes R-M ont évolué pour permettre aux bactéries de reconnaître et d’éliminer l’ADN étranger17. En effet, plusieurs études sur B. burgdorferi ont démontré que l’efficacité de la transformation augmente lorsque la source de l’ADN est B. burgdorferi plutôt qu’Escherichia coli13,16. Malheureusement, l’acquisition de la concentration élevée requise d’ADN pour l’électroporation de B. burgdorferi est une perspective coûteuse et chronophage. Une autre préoccupation potentielle lors de l’électroporation et de la sélection d’isolats à faible passage est que le processus semble favoriser les transformants qui ont perdu le plasmide critique associé à la virulence, lp2514,18,19; ainsi, l’acte même de manipuler génétiquement des isolats de B. burgdorferi à faible passage par électroporation peut sélectionner des clones qui ne conviennent pas à une analyse biologiquement pertinente dans le cycle enzootique20. Compte tenu de ces problèmes, un système dans lequel l’ADN hétérologue pourrait être électrotransformé en clones de B. burgdorferi à passage élevé, puis transféré dans des isolats infectieux à faible passage par une méthode autre que l’électroporation pourrait être un ajout bienvenu à la collection croissante d’outils moléculaires disponibles pour une utilisation dans le spirochète de la maladie de Lyme.

En plus de la transformation (l’absorption de l’ADN nu), il existe deux autres mécanismes par lesquels les bactéries absorbent régulièrement l’ADN hétérologue : la conjugaison, qui est l’échange d’ADN entre bactéries en contact physique direct les unes avec les autres, et la transduction, qui est l’échange d’ADN médié par un bactériophage21. En effet, la capacité du bactériophage à médier HGT a été utilisée comme outil expérimental pour disséquer les processus moléculaires dans un certain nombre de systèmes bactériens22,23,24. B. burgdorferi n’est pas naturellement compétent pour l’absorption de l’ADN nu, et il y a peu de preuves que B. burgdorferi code l’appareil nécessaire pour favoriser une conjugaison réussie. Des rapports antérieurs ont décrit, cependant, l’identification et la caractérisation préliminaire de φBB-1, un bactériophage tempéré de B. burgdorferi25,26,27,28. φBB-1 regroupe une famille de plasmides de 30 kb trouvés dans B. burgdorferi25; Les membres de cette famille ont été désignés CP32. Conformément au rôle de φBB-1 dans la participation au HGT parmi les souches de B. burgdorferi, Stevenson et al. ont rapporté un cp32 identique trouvé dans deux souches avec des cp32 autrement disparates, suggérant un partage récent de ce cp32 entre ces deux souches, probablement par transduction29. Il existe également des preuves d’une recombinaison significative via HGT parmi les cp32 dans un génome 30,31,32,33 par ailleurs relativement stable. Enfin, la capacité de φBB-1 à transduire à la fois cp32s et l’ADN vectoriel navette hétérologue entre cellules de la même souche et entre cellules de deux souches différentes a été démontrée précédemment27,28. Compte tenu de ces résultats, φBB-1 a été proposé comme un autre outil à développer pour la dissection de la biologie moléculaire de B. burgdorferi.

L’objectif de ce rapport est de détailler une méthode pour induire et purifier le phage φBB-1 de B. burgdorferi, ainsi que de fournir un protocole pour effectuer un test de transduction entre clones de B. burgdorferi et sélectionner et cribler des transducteurs potentiels.

Protocol

Toutes les expériences utilisant de l’ADN recombinant et des organismes BSL-2 ont été examinées et approuvées par le comité institutionnel de biosécurité de l’Université Quinnipiac. 1. Préparation de la culture de B. burgdorferi pour la production de φBB-1 Préparer le milieu Barbour-Stoenner-Kelly complété par 6,6 % de sérum normal de lapin (BSK)15. Pour 1 L de 1x BSK, combiner les composants énumérés au tableau …

Representative Results

L’utilisation de bactériophages pour déplacer l’ADN entre des souches ou des clones de B. burgdorferi plus facilement transformables qui sont récalcitrants à l’électrotransformation représente un autre outil pour l’étude moléculaire continue des déterminants de la maladie de Lyme. Le test de transduction décrit ici peut être modifié au besoin pour faciliter le mouvement de l’ADN entre les clones d’intérêt en utilisant un ou deux antibiotiques pour la sélection de transducteurs potentie…

Discussion

L’utilisation de la transduction pourrait représenter une méthode pour surmonter au moins certaines des barrières biologiques et techniques associées à l’électrotransformation de B. burgdorferi 1,4,13,37. Dans de nombreux systèmes, le bactériophage peut déplacer l’ADN de l’hôte (non prophage) entre les cellules bactériennes par transduction généralisée ou spécial…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

L’auteur tient à remercier Shawna Reed, D. Scott Samuels et Patrick Secor pour leur discussion utile, ainsi que Vareeon (Pam) Chonweerawong pour leur assistance technique. Ce travail a été soutenu par le Département des sciences biomédicales et des subventions de recherche du corps professoral à Christian H. Eggers de l’École des sciences de la santé de l’Université Quinnipiac.

Materials

1 L filter units (PES, 0.22 µm pore size) Millipore Sigma S2GPU10RE
12 mm x 75 mm tube (dual position cap) (polypropylene) USA Scientific 1450-0810 holds 4 mL with low void volume (for induction)
15 mL conical centrifuge tubes (polypropylene) USA Scientific 5618-8271
1-methyl-3-nitroso-nitroguanidine (MNNG) Millipore Sigma CAUTION: potential carcinogen; no longer readily available, have not tested offered substitute
5.75" Pasteur Pipettes (cotton-plugged/borosilicate glass/non-sterile) Thermo Fisher Scientific 13-678-8A autoclave prior to use
50 mL conical centrifuge tubes (polypropylene) USA Scientific 1500-1211
Absolute ethanol
Agarose LE Dot Scientific inc. AGLE-500
Bacto Neopeptone Gibco DF0119-17-9
Bacto TC Yeastolate Gibco 255772
Bovine serum albumin (serum replacement grade) Gemini Bio-Products 700-104P
Chloroform (for molecular biology) Thermo Fisher Scientific BP1145-1 CAUTION: volatile organic; use only in a chemical fume hood
CMRL-1066 w/o L-Glutamine (powder) US Biological C5900-01 cell culture grade
Erythromycin Research Products International Corp E57000-25.0
Gentamicin reagent solution Gibco 15750-060
Glucose (Dextrose Anhydrous) Thermo Fisher Scientific BP350-500
HEPES Thermo Fisher Scientific BP310-500
Kanamycin sulfate Thermo Fisher Scientific 25389-94-0
Millex-GS (0.22 µM pore size) Millipore Sigma SLGSM33SS to filter sterilize antibiotics and other small volume solutions
Mitomycin C Thermo Fisher Scientific BP25312 CAUTION: potential carcinogen; use only in a chemical fume hood
N-acetyl-D-glucosamine MP Biomedicals, LLC 100068
Oligonucleotides (primers for PCR) IDT DNA
OmniPrep (total genomic extraction kit) G Biosciences 786-136
Petri Dish (100 mm × 15 mm) Thermo Fisher Scientific FB0875712
Petroff-Hausser counting chamber Hausser scientific HS-3900
Petroff-Hausser counting chamber cover glass Hausser scientific HS-5051
Polyethylene glycol 8000 (PEG) Thermo Fisher Scientific BP233-1
Rabbit serum non-sterile trace-hemolyzed young (NRS) Pel-Freez Biologicals 31119-3 heat inactivate as per manufacturer's instructions
Semi-micro UV transparent cuvettes USA Scientific 9750-9150
Sodium bicarbonate Thermo Fisher Scientific BP328-500
Sodium chloride Thermo Fisher Scientific BP358-1
Sodium pyruvate Millipore Sigma P8674-25G
Spectronic Genesys 5 Thermo Fisher Scientific
Streptomycin sulfate solution Millipore Sigma S6501-50G
Trisodium citrate dihydrate Millipore Sigma S1804-500G sodium citrate for BSK

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Eggers, C. H. Phage-Mediated Genetic Manipulation of the Lyme Disease Spirochete Borrelia burgdorferi. J. Vis. Exp. (187), e64408, doi:10.3791/64408 (2022).

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