라임병 스피로체테 보렐리아 부르그도르페리의 파지 매개 유전자 조작
Summary
박테리아 세포 사이에서 DNA를 이동하는 박테리오파지의 능력은 박테리아 숙주의 유전자 조작에 효과적인 도구입니다. 여기에 제시된 것은 보렐리아 부르그도르페리의 박테리오파지인 φBB-1을 유도, 회수 및 사용하여 라임병 스피로체의 다른 균주 사이에서 이종 DNA를 형질도입하는 방법론입니다.
Abstract
스피로체테 Borrelia burgdorferi 에 외래 DNA를 도입하는 것은 거의 전적으로 전기 천공을 사용한 형질전환에 의해 이루어졌습니다. 이 과정은 라임 병 스피로 체에서 다른 더 잘 특성화 된 그람 음성 박테리아에 비해 효율성이 현저히 낮습니다. 형질전환의 성공률은 특정 배경에서 농축된 양의 고품질 DNA에 크게 의존하며 상당한 변형 간 변동성을 갖습니다. 외래 DNA (즉, 셔틀 벡터, 형광 리포터 및 항생제 내성 마커)를 B. burgdorferi 에 도입하기위한 대체 수단은 라임 병 스피로 체의 유전자 조작을위한 유용한 도구의 군비에 중요한 추가 물이 될 수 있습니다. 박테리오파지는 형질 도입이라는 과정에서 박테리아 사이에서 DNA를 이동시키는 자연적인 메커니즘으로 잘 알려져 있습니다. 이 연구에서는 유비쿼터스 보렐 리알 파지 φBB-1을 사용하여 동일하고 다른 유전 적 배경을 가진 B. burgdorferi 세포 사이에서 DNA를 형질 도입하는 방법이 개발되었습니다. 형질도입된 DNA는 보렐리알 DNA와 작은 셔틀 벡터 형태의 이종 DNA를 모두 포함한다. 이 시연은 라임 병 스피로 체의 유전자 조작을위한 전기 천공을 보완하기 위해 파지 매개 형질 도입의 잠재적 인 사용을 시사한다. 이 보고서는 B. burgdorferi로부터 파지 φBB-1의 유도 및 정제, 형질 도입 분석에서이 파지의 사용 및 잠재적 형질 도입체의 선택 및 스크리닝을 위한 방법을 설명합니다.
Introduction
스피로 체탈 박테리아 Borrelia burgdorferi의 유전자 조작을위한 도구의 개발은 라임 병 1,2,3,4의 본질에 대한 이해에 헤매랄 수없는 가치를 더했습니다. B. burgdorferi는 작은 선형 염색체와 선형 및 원형 플라스미드 5,6으로 구성된 비정상적으로 복잡한 게놈을 가지고 있습니다. 자발적인 플라스미드 손실, 유전자 내 재배열 (동일한 유기체 내에서 한 플라스미드에서 다른 플라스미드로의 유전자 이동) 및 수평 유전자 전달 (HGT, 두 유기체 간의 DNA 이동)은 B. burgdorferi 사이에 어지러운 양의 유전 적 이질성을 야기했습니다 (예를 들어, Schutzer et al.7 참조). 생성된 유전자형(또는 “균주”)은 모두 동일한 종의 구성원이지만 다른 포유류 숙주 8,9,10,11로 전달하고 감염시키는 능력에 영향을 미치는 유전적 차이를 갖는다. 이 보고서에서 “균주”라는 용어는 자연적으로 파생 된 특정 유전 적 배경을 가진 B. burgdorferi를 지칭하는 데 사용됩니다. 용어 “클론”은 특정 목적을 위해 또는 실험적 조작의 결과로서 유전적으로 변형된 균주를 지칭하기 위해 사용될 것이다.
B. burgdorferi에서 사용할 수 있는 분자 도구 상자에는 선택 가능한 마커, 유전자 리포터, 셔틀 벡터, 트랜스포존 돌연변이 유발, 유도성 프로모터 및 역선택 마커가 포함됩니다(검토를 위해 Drektrah 및 Samuels12 참조). 이러한 방법론을 효과적으로 사용하려면 B. burgdorferi 관심 균주에 이종 (외래) DNA를 인위적으로 도입해야합니다. B. burgdorferi에서 이종 DNA의 도입은 거의 전적으로 전기 천공을 통해 이루어지며, 이는 전기 펄스를 사용하여 박테리아 막을 매체에 도입 된 작은 DNA 조각에 일시적으로 투과 할 수있게하는 방법입니다1. 대부분의 세포(≥99.5%로 추정됨)는 펄스에 의해 사멸되지만, 나머지 세포는 이종성 DNA13을 보유하는 높은 빈도를 갖는다. DNA를 박테리아에 도입하는 가장 효율적인 방법 중 하나로 간주되지만 B. burgdorferi로의 전기 천공 빈도는 매우 낮습니다 (5 × 104에서 5 × 106 세포에 1 형질 전환체에 이르기까지)13. 더 높은 주파수 변형을 달성하는 데 방해가되는 장벽은 기술적 인 것과 생물학적인 것 같습니다. B. burgdorferi의 성공적인 전기 천공에 대한 기술적 장벽에는 필요한 DNA (>10 μg)의 양과 스피로 체가 정확히 올바른 성장 단계 (중간 로그, 2 × 10 7 세포 · mL-1 및 7 × 107 세포 · mL-1)에 있어야한다는 요구 사항이 포함됩니다 전기 적격 세포12,13. 그러나 이러한 기술적 장벽은 생물학적 장벽보다 극복하기가 더 쉬울 수 있습니다.
라임병 연구자들은 B. burgdorferi 클론이 유전적으로 조작될 수 있는 능력과 관련하여 크게 두 가지 범주로 나눌 수 있음을 인식합니다13,14. 높은 통과, 실험실 적응 분리 물은 종종 쉽게 변형되지만 일반적으로 감염성에 필수적인 플라스미드를 잃고 생리 학적으로 비정상적인 방식으로 행동하며 포유류 숙주를 감염시킬 수 없거나 진드기 벡터12,13 내에서 지속될 수 없습니다. 이 클론은 실험실 내에서 스피로체의 분자 생물학을 해부하는 데 유용했지만 동물주기의 생물학적 맥락에서 스피로 체를 연구하는 데는 거의 가치가 없습니다. 반면에 저계대 감염성 분리는 감염 상태를 반영하는 생리학적 방식으로 행동하고 감염 주기를 완료할 수 있지만 일반적으로 이종 DNA의 도입에 저항하므로 연구12,13에서 조작하기 어렵습니다. 저-계대 분리물을 형질전환시키는 어려움은 적어도 두 가지 상이한 요인과 관련된다: (i) 저-통로 분리물은 특히 전기천공에 요구되는 고밀도 조건 하에서 종종 서로 단단히 응집되어, 따라서 많은 세포가 전하의 완전한 인가 또는 배지 내의 DNA에 접근하는 것을 차단한다(13, 15); (ii) B. burgdorferi는 고-통로 분리물(14,16)에서 손실될 수 있는 적어도 2개의 상이한 플라스미드 매개 제한-변형(R-M) 시스템을 암호화한다. R-M 시스템은 박테리아가 외부 DNA17을 인식하고 제거 할 수 있도록 진화했습니다. 실제로 B. burgdorferi에 대한 여러 연구에 따르면 DNA의 출처가 대장균이 아닌 B. burgdorferi 일 때 형질 전환 효율이 증가합니다 13,16. 불행히도 B. burgdorferi로부터 전기 천공에 필요한 고농도의 DNA를 얻는 것은 비용이 많이 들고 시간이 많이 소요되는 전망입니다. 저-계대 분리물을 전기천공 및 선택할 때 또 다른 잠재적인 우려는 이 공정이 임계 병독성 관련 플라스미드 lp2514,18,19; 따라서, 전기천공을 통해 저계대 B. burgdorferi 분리물을 유전적으로 조작하는 바로 그 행위는 동물성 주기20 내에서 생물학적으로 관련된 분석에 적합하지 않은 클론을 선택할 수 있다. 이러한 문제를 감안할 때, 이종 DNA가 높은 통로의 B. burgdorferi 클론으로 전기 변환 된 다음 전기 천공 이외의 방법으로 저 통로 감염 분리로 전달 될 수있는 시스템은 라임 병 스피로 체에 사용할 수있는 분자 도구의 증가하는 컬렉션에 환영할만한 추가 사항이 될 수 있습니다.
형질전환(알몸 DNA의 흡수) 이외에, 박테리아가 규칙적으로 이종 DNA를 흡수하는 두 가지 다른 메커니즘이 있다: 서로 직접 물리적으로 접촉하는 박테리아 사이의 DNA 교환인 접합과 박테리오파지(21)에 의해 매개되는 DNA의 교환인 형질도입. 실제로, HGT를 매개하는 박테리오파지의 능력은 다수의 박테리아 시스템 내에서 분자 과정을 해부하기 위한 실험 도구로서 사용되어 왔다(22,23,24). B. burgdorferi는 네이키드 DNA의 흡수에 자연적으로 유능하지 않으며 B. burgdorferi가 성공적인 접합을 촉진하는 데 필요한 장치를 암호화한다는 증거는 거의 없습니다. 그러나 이전 보고서에서는 B. burgdorferi25,26,27,28의 온대 박테리오파지 인 φBB-1의 식별 및 예비 특성화를 설명했습니다. φBB-1은 B. burgdorferi25 내에서 발견되는 30kb 플라스미드 계열을 패키징합니다. 이 제품군의 구성원은 CP32로 지정되었습니다. B. burgdorferi 균주 중 HGT에 참여하는 φBB-1의 역할과 일치하여, Stevenson et al. 그렇지 않으면 이질적인 cp32를 가진 두 균주에서 동일한 cp32가 발견되었다고 보고했으며, 이는 형질도입29를 통해 이 두 균주 사이에서 이 cp32의 최근 공유를 시사합니다. 또한 상대적으로 안정적인 게놈30,31,32,33에서 cp32 중 HGT를 통한 상당한 재조합의 증거가 있습니다. 마지막으로, 동일한 균주의 세포 사이 및 2개의 상이한 균주의 세포 사이에서 cp32s 및 이종 셔틀 벡터 DNA 둘 다를 형질도입하는 φBB-1의 능력은 이전에 입증되었다27,28. 이러한 발견을 감안할 때, φBB-1은 B. burgdorferi의 분자 생물학의 해부를 위해 개발 될 또 다른 도구로 제안되었습니다.
이 보고서의 목적은 B. burgdorferi로부터 파지 φBB-1을 유도 및 정제하는 방법을 자세히 설명하고 B. burgdorferi 클론 간의 형질도입 분석을 수행하고 잠재적 형질도입체를 선택 및 스크리닝하기 위한 프로토콜을 제공하는 것입니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
형질 도입의 사용은 B. burgdorferi 1,4,13,37의 전기 변환과 관련된 생물학적 및 기술적 장벽 중 적어도 일부를 극복하는 한 가지 방법을 나타낼 수 있습니다. 많은 시스템에서, 박테리오파지는 일반화 또는 특수 형질도입22,23,24,49,50</…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 유용한 토론에 대해 Shawna Reed, D. Scott Samuels 및 Patrick Secor와 기술 지원에 대해 Vareeon (Pam) Chonweerawong에게 감사드립니다. 이 연구는 생물 의학부와 퀴니피악 대학교 보건 과학 학교의 Christian H. Eggers에 대한 교수진 연구 보조금의 지원을 받았습니다.
Materials
| 1 L filter units (PES, 0.22 µm pore size) | Millipore Sigma | S2GPU10RE | |
| 12 mm x 75 mm tube (dual position cap) (polypropylene) | USA Scientific | 1450-0810 | holds 4 mL with low void volume (for induction) |
| 15 mL conical centrifuge tubes (polypropylene) | USA Scientific | 5618-8271 | |
| 1-methyl-3-nitroso-nitroguanidine (MNNG) | Millipore Sigma | CAUTION: potential carcinogen; no longer readily available, have not tested offered substitute | |
| 5.75" Pasteur Pipettes (cotton-plugged/borosilicate glass/non-sterile) | Thermo Fisher Scientific | 13-678-8A | autoclave prior to use |
| 50 mL conical centrifuge tubes (polypropylene) | USA Scientific | 1500-1211 | |
| Absolute ethanol | |||
| Agarose LE | Dot Scientific inc. | AGLE-500 | |
| Bacto Neopeptone | Gibco | DF0119-17-9 | |
| Bacto TC Yeastolate | Gibco | 255772 | |
| Bovine serum albumin (serum replacement grade) | Gemini Bio-Products | 700-104P | |
| Chloroform (for molecular biology) | Thermo Fisher Scientific | BP1145-1 | CAUTION: volatile organic; use only in a chemical fume hood |
| CMRL-1066 w/o L-Glutamine (powder) | US Biological | C5900-01 | cell culture grade |
| Erythromycin | Research Products International Corp | E57000-25.0 | |
| Gentamicin reagent solution | Gibco | 15750-060 | |
| Glucose (Dextrose Anhydrous) | Thermo Fisher Scientific | BP350-500 | |
| HEPES | Thermo Fisher Scientific | BP310-500 | |
| Kanamycin sulfate | Thermo Fisher Scientific | 25389-94-0 | |
| Millex-GS (0.22 µM pore size) | Millipore Sigma | SLGSM33SS | to filter sterilize antibiotics and other small volume solutions |
| Mitomycin C | Thermo Fisher Scientific | BP25312 | CAUTION: potential carcinogen; use only in a chemical fume hood |
| N-acetyl-D-glucosamine | MP Biomedicals, LLC | 100068 | |
| Oligonucleotides (primers for PCR) | IDT DNA | ||
| OmniPrep (total genomic extraction kit) | G Biosciences | 786-136 | |
| Petri Dish (100 mm × 15 mm) | Thermo Fisher Scientific | FB0875712 | |
| Petroff-Hausser counting chamber | Hausser scientific | HS-3900 | |
| Petroff-Hausser counting chamber cover glass | Hausser scientific | HS-5051 | |
| Polyethylene glycol 8000 (PEG) | Thermo Fisher Scientific | BP233-1 | |
| Rabbit serum non-sterile trace-hemolyzed young (NRS) | Pel-Freez Biologicals | 31119-3 | heat inactivate as per manufacturer's instructions |
| Semi-micro UV transparent cuvettes | USA Scientific | 9750-9150 | |
| Sodium bicarbonate | Thermo Fisher Scientific | BP328-500 | |
| Sodium chloride | Thermo Fisher Scientific | BP358-1 | |
| Sodium pyruvate | Millipore Sigma | P8674-25G | |
| Spectronic Genesys 5 | Thermo Fisher Scientific | ||
| Streptomycin sulfate solution | Millipore Sigma | S6501-50G | |
| Trisodium citrate dihydrate | Millipore Sigma | S1804-500G | sodium citrate for BSK |
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