يصف هذا البروتوكول منهجيات إنشاء عضويات ظهارية بطانة الرحم للفأر للتعبير الجيني والتحليلات النسيجية.
تبطن أنسجة بطانة الرحم التجويف الداخلي للرحم وتخضع للسيطرة الدورية للإستروجين والبروجستيرون. وهو نسيج يتكون من ظهارة لمعية وغدية ، ومقصورة انسجة ، وشبكة أوعية دموية ، ومجموعة معقدة من الخلايا المناعية. كانت نماذج الفئران أداة قوية لدراسة بطانة الرحم ، وكشفت عن الآليات الحاسمة التي تتحكم في الزرع والمشيمة والسرطان. يقدم التطور الأخير للثقافات العضوية البطانية 3D نموذجا حديثا لتشريح مسارات الإشارات التي تكمن وراء بيولوجيا بطانة الرحم. يعد إنشاء عضويات بطانة الرحم من نماذج الفئران المعدلة وراثيا ، وتحليل نسخها ، وتصور مورفولوجيتها بدقة خلية واحدة أدوات حاسمة لدراسة أمراض بطانة الرحم. تحدد هذه الورقة طرق إنشاء ثقافات 3D لظهارة بطانة الرحم من الفئران وتصف تقنيات لتحديد التعبير الجيني وتحليل أنسجة الكائنات العضوية. الهدف هو توفير مورد يمكن استخدامه لإنشاء وزراعة ودراسة التعبير الجيني والخصائص المورفولوجية للعضويات الظهارية البطانية.
بطانة الرحم – النسيج المخاطي المبطن الداخلي لتجويف الرحم – هي نسيج فريد وديناميكي للغاية يلعب أدوارا حاسمة في الصحة الإنجابية للمرأة. خلال العمر الإنجابي ، يحمل بطانة الرحم القدرة على الخضوع لمئات الدورات من الانتشار والتمايز والانهيار ، بتنسيق من العمل المتضافر لهرمونات المبيض – الاستروجين والبروجستيرون. كشفت الدراسات التي أجريت على الفئران المعدلة وراثيا عن آليات بيولوجية أساسية تدعم استجابة بطانة الرحم للهرمونات والتحكم في زرع الجنين ، ونزع الخلايا اللحمية ، والحمل1. ومع ذلك ، كانت الدراسات في المختبر محدودة بسبب الصعوبات في الحفاظ على أنسجة بطانة الرحم الأولية غير المحولة للفأر في مزارع الخلايا ثنائية الأبعاد التقليدية2،3. تقدم التطورات الحديثة في ثقافة أنسجة بطانة الرحم كأنظمة أعضاء 3D ، أو عضويات ، فرصة جديدة للتحقيق في المسارات البيولوجية التي تتحكم في تجديد خلايا بطانة الرحم والتمايز. تم تطوير أنظمة عضوية بطانة الرحم للفأر والإنسان من ظهارة بطانة الرحم النقية المغلفة في مصفوفات مختلفة4،5 ، في حين تم استزراع بطانة الرحم البشرية كمزارع ظهارية / انسجة خالية من السقالات6،7 ، ومؤخرا كمجموعات ظهارية / انسجة مغلفة بالكولاجين8 . يتم دعم النمو والإمكانات التجديدية للثقافات العضوية الظهارية من خلال مزيج محدد من عوامل النمو ومثبطات الجزيئات الصغيرة التي تم تحديدها تجريبيا لزيادة نمو وتجديد المواد العضوية4،5،9. علاوة على ذلك ، فإن القدرة على تجميد وإذابة عضويات بطانة الرحم تسمح بتخزين عضويات بطانة الرحم على المدى الطويل من الفئران والبشر للدراسات المستقبلية.
كشفت الفئران المعدلة وراثيا عن مسارات الإشارات المعقدة التي تتحكم في الحمل المبكر وإزالة الترسبات ، وقد تم استخدامها كنماذج لفقدان الحمل وسرطان بطانة الرحم وبطانة الرحم. تم تحقيق هذه الدراسات الجينية إلى حد كبير مع حذف خاص بالخلية للأليلات الجانبية loxP (“floxed”) باستخدام cre recombinases التي تنشط بشكل خاص في الأنسجة التناسلية الأنثوية. تتضمن نماذج الفئران هذه مستقبلات البروجسترون10 المستخدمة على نطاق واسع ، والتي لها نشاط إعادة اتحاد قوي في الأنسجة الظهارية واللحمية البطانية ، اللاكتوفيرين i-cre ، الذي يحفز إعادة التركيب الظهاري البطاني الرحمي في الفئران البالغة11 ، أو Wnt7a-cre ، مما يؤدي إلى حذف خاص بالظهارة في الأنسجة المشتقة من مولريان12 . وفرت زراعة أنسجة بطانة الرحم من نماذج الفئران المعدلة وراثيا مثل الكائنات العضوية ثلاثية الأبعاد فرصة ممتازة للتحقيق في بيولوجيا بطانة الرحم وتسهيل تحديد عوامل النمو ومسارات الإشارات التي تتحكم في تجديد خلايا بطانة الرحم والتمايز13,14. يتم وصف طرق عزل وثقافة أنسجة بطانة الرحم للفأر في الأدبيات والإبلاغ عن استخدام استراتيجيات إنزيمية مختلفة لعزل ظهارة الرحم للزراعة اللاحقة للعضويات الظهارية البطانية4. بينما توفر الأدبيات السابقة إطارا نقديا لبروتوكولات الثقافة العضوية الظهارية البطانية4،5،6 ، توفر هذه الورقة طريقة واضحة وشاملة لتوليد هذه الكائنات العضوية وصيانتها ومعالجتها وتحليلها. توحيد هذه التقنيات مهم لتسريع التقدم في مجال البيولوجيا الإنجابية للمرأة. هنا ، نبلغ عن منهجية مفصلة للتنقية الأنزيمية والميكانيكية للأنسجة الظهارية البطانية للفأر للثقافة اللاحقة من عضويات بطانة الرحم في سقالة مصفوفة هلام. كما نصف منهجيات التحليلات النسيجية والجزيئية النهائية للعضويات الظهارية بطانة الرحم المغلفة بمصفوفة الهلام.
هنا ، نصف طرق توليد عضويات ظهارية بطانة الرحم من بطانة الرحم للفأر والبروتوكولات المستخدمة بشكل روتيني لتحليلها في المراحل النهائية. تعتبر عضويات بطانة الرحم أداة قوية لدراسة الآليات التي تتحكم في الأمراض المرتبطة ببطانة الرحم ، مثل التهاب بطانة الرحم وسرطان بطانة الرحم وفشل الزرع. ذكرت…
The authors have nothing to disclose.
نشكر الدكتورة ستيفاني بانجاس والدكتور مارتن إم ماتزوك (M.M.M.) على القراءة النقدية وتحرير مخطوطتنا. تم دعم الدراسات من قبل منح معهد يونيس كينيدي شرايفر الوطني لصحة الطفل والتنمية البشرية R00-HD096057 (DM) و R01-HD105800 (DM) و R01-HD032067 (M.M.M.) و R01-HD110038 (M.M.M.) ، ومنحة دعم مركز السرطان NCI- P30 (NCI-CA125123). ديانا مونسيفيس ، دكتوراه حاصلة على جائزة الحمل من الجيل التالي من صندوق بوروز ويلكوم.
Organoid Media Formulation | |||
Name | Company | Catalog Number | Final concentration |
Corning Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix, *LDEV-free | Corning | 354230 | 100% |
Trypsin from Bovine Pancreas | Sigma Aldrich | T1426-1G | 1% |
Advanced DMEM/F12 | Life Technologies | 12634010 | 1X |
N2 supplement | Life Technologies | 17502048 | 1X |
B-27™ Supplement (50X), minus vitamin A | Life Technologies | 12587010 | 1X |
Primocin | Invivogen | ant-pm-1 | 100 µg/mL |
N-Acetyl-L-cysteine | Sigma Aldrich | A9165-5G | 1.25 mM |
L-glutamine | Life Technologies | 25030024 | 2 mM |
Nicotinamide | Sigma Aldrich | N0636-100G | 10 nM |
ALK-4, -5, -7 inhibitor, A83-01 | Tocris | 2939 | 500 nM |
Recombinant human EGF | Peprotech | AF-100-15 | 50 ng/mL |
Recombinant human Noggin | Peprotech | 120-10C | 100 ng/mL |
Recombinant human Rspondin-1 | Peprotech | 120-38 | 500 ng/mL |
Recombinant human FGF-10 | Peprotech | 100-26 | 100 ng/mL |
Recombinant human HGF | Peprotech | 100-39 | 50 ng/mL |
WNT3a | R&D systems | 5036-WN | 200 ng/mL |
Other supplies and reagents | |||
Name | Company | Catalog Number | Final concentration |
Collagenase from Clostridium histolyticum | Sigma Aldrich | C0130-1G | 5 mg/mL |
Deoxyribonuclease I from bovine pancreas | Sigma Aldrich | DN25-100MG | 2 mg/mL |
DPBS, no calcium, no magnesium | ThermoFisher | 14190-250 | 1X |
HBSS, no calcium, no magnesium | ThermoFisher | 14170112 | 1X |
Falcon Polystyrene Microplates (24-Well) | Fisher Scientific | #08-772-51 | |
Falcon Polystyrene Microplates (12-Well) | Fisher Scientific | #0877229 | |
Falcon Cell Strainers, 40 µm | Fisher Scientific | #08-771-1 | |
Direct-zol RNA MiniPrep (50 µg) | Genesee Scientific | 11-331 | |
Trizol reagent | Invitrogen | 15596026 | |
DMEM/F-12, HEPES, no phenol red | ThermoFisher | 11039021 | |
Fetal Bovine Serum, Charcoal stripped | Sigma Aldrich | F6765-500ML | 2% |
Estratiol (E2) | Sigma Aldrich | E1024-1G | 10 nM |
Formaldehyde 16% in aqueous solution, EM Grade | VWR | 15710 | 4% |
Epredia Cassette 1 Slotted Tissue Cassettes | Fisher Scientific | 1000961 | |
Epredia Stainless-Steel Embedding Base Molds | Fisher Scientific | 64-010-15 | |
Ethanol, 200 proof (100%) | Fisher Scientific | 22-032-601 | |
Histoclear | Fisher Scientific | 50-899-90147 | |
Permount Mounting Medium | Fisher Scientific | 50-277-97 | |
Epredia Nylon Biopsy Bags | Fisher Scientific | 6774010 | |
HistoGel Specimen Processing Gel | VWR | 83009-992 | |
Hematoxylin solution Premium | VWR | 95057-844 | |
Eosin Y (yellowish) solution Premium | VWR | 95057-848 | |
TBS Buffer, 20X, pH 7.4 | GenDEPORT | T8054 | 1X |
TBST (10X), pH 7.4 | GenDEPORT | T8056 | 1X |
Citric acid | Sigma Aldrich | C0759-1KG | |
Sodium citrate tribasic dihydrate | Sigma Aldrich | S4641-500G | |
Tween20 | Fisher Scientific | BP337-500 | |
Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma Aldrich | A2153-100G | 3% |
DAPI Solution (1 mg/mL) | ThermoFisher | 62248 | 1:1000 dilution |
VECTASHIELD Antifade Mounting Medium | Vector Labs | H-1000-10 | |
Clear Nail Polish | Fisher Scientific | NC1849418 | |
Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 22037246 | |
VWR Micro Cover Glasses | VWR | 48393-106 | |
SuperScript VILO Master Mix | ThermoFisher | 11755050 | |
SYBR Green PCR Master Mix | ThermoFisher | 4364346 | |
Krt8 Antibody (TROMA-I) | DSHB | TROMA-I | 1:50 dilution |
Vimentin Antobody | Cell Signaling | 5741S | 1:200 dilution |
Donkey anti-Rat IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 |
ThermoFisher | A-21209 | 1:250 dilution |
Donkey anti-Rabbin IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 |
ThermoFisher | A-21206 | 1:250 dilution |
ZEISS Stemi 508 Stereo Microscope | ZEISS | ||
ZEISS Axio Vert.A1 Inverted Routine Microscope with digital camera | ZEISS | ||
Primer Sequence | Forward (5'-3') | Reverse (5'-3') | _ |
Lipocalin 2 (Lcn2) | GCAGGTGGTACGTTGTGGG | CTCTTGTAGCTCATAGATGGTGC | |
Lactoferrin (Ltf) | TGAGGCCCTTGGACTCTGT | ACCCACTTTTCTCATCTCGTTC | |
Progesterone (Pgr) | CCCACAGGAGTTTGTCAAGCTC | TAACTTCAGACATCATTTCCGG | |
Glyceraldehyde 3 phosphate dehydrogenase (Gapdh) | CAATGTGTCCGTCGTGGATCT | GCCTGCTTCACCACCTTCTT |