Dit protocol beschrijft methodologieën om endometriumepitheelorganoïden van muizen vast te stellen voor genexpressie en histologische analyses.
Endometriumweefsel bekleedt de binnenholte van de baarmoeder en staat onder de cyclische controle van oestrogeen en progesteron. Het is een weefsel dat is samengesteld uit luminaal en klierepitheel, een stromaal compartiment, een vasculair netwerk en een complexe immuuncelpopulatie. Muismodellen zijn een krachtig hulpmiddel geweest om het baarmoederslijmvlies te bestuderen en onthullen kritieke mechanismen die implantatie, placentatie en kanker beheersen. De recente ontwikkeling van 3D-endometriumorganoïde culturen presenteert een state-of-the-art model om de signaalroutes te ontleden die ten grondslag liggen aan endometriumbiologie. Het vaststellen van endometriumorganoïden uit genetisch gemanipuleerde muismodellen, het analyseren van hun transcriptomen en het visualiseren van hun morfologie met een resolutie van één cel zijn cruciale hulpmiddelen voor de studie van endometriumziekten. Dit artikel schetst methoden om 3D-culturen van endometriumepitheel van muizen vast te stellen en beschrijft technieken om genexpressie te kwantificeren en de histologie van de organoïden te analyseren. Het doel is om een bron te bieden die kan worden gebruikt om de genexpressie en morfologische kenmerken van endometriumepitheelorganoïden vast te stellen, te kweken en te bestuderen.
Het endometrium – het binnenste bekledingsslijmvliesweefsel van de baarmoederholte – is een uniek en zeer dynamisch weefsel dat een cruciale rol speelt in de reproductieve gezondheid van een vrouw. Tijdens de reproductieve levensduur heeft het endometrium het potentieel om honderden cycli van proliferatie, differentiatie en afbraak te ondergaan, gecoördineerd door de gecoördineerde werking van de eierstokhormonen – oestrogeen en progesteron. Studies van genetisch gemanipuleerde muizen hebben fundamentele biologische mechanismen blootgelegd die de endometriumrespons op hormonen en de controle van embryo-implantatie, stromale celdecidualisatie en zwangerschap ondersteunen1. In vitro studies zijn echter beperkt geweest vanwege problemen bij het handhaven van niet-getransformeerde primaire endometriumweefsels van muizen in traditionele 2D-celculturen 2,3. Recente ontwikkelingen in de cultuur van endometriumweefsels als 3D-orgaansystemen, of organoïden, bieden een nieuwe kans om biologische routes te onderzoeken die de regeneratie en differentiatie van endometriumcellen regelen. Muis- en humaan endometriumorganoïde systemen zijn ontwikkeld uit zuiver endometriumepitheel ingekapseld in verschillende matrices 4,5, terwijl menselijk endometrium is gekweekt als steigervrije epitheliale / stromale co-culturen 6,7, en meer recent als collageen-ingekapselde epitheliale / stromale assembloïden8 . De groei en het regeneratieve potentieel van epitheliale organoïde culturen wordt ondersteund door een gedefinieerde cocktail van groeifactoren en kleine molecuulremmers die empirisch zijn vastgesteld om de groei en regeneratie van de organoïden te maximaliseren 4,5,9. Bovendien maakt het vermogen om endometriumorganoïden te bevriezen en te ontdooien het langdurig bankieren van endometriumorganoïden van muizen en mensen mogelijk voor toekomstige studies.
Genetisch gemanipuleerde muizen hebben de complexe signaalroutes onthuld die de vroege zwangerschap en decidualisatie regelen, en zijn gebruikt als modellen van zwangerschapsverlies, endometriumkanker en endometriose. Deze genetische studies zijn grotendeels bereikt met celspecifieke deletie van loxP geflankeerde allelen (“floxed”) met behulp van cre-recombinasen die specifiek actief zijn in vrouwelijke voortplantingsweefsels. Deze muismodellen omvatten de veelgebruikte progesteronreceptor-cre10, die een sterke recombinase-activiteit heeft in de endometriumepitheel- en stromale weefsels, lactoferrine i-cre, dat endometriumepitheelrecombinatie induceert bij volwassen muizen11, of Wnt7a-cre, dat epitheliale-specifieke deletie veroorzaakt in van Müller afgeleide weefsels12 . Het kweken van endometriumweefsels uit genetisch gemanipuleerde muismodellen als 3D-organoïden heeft een uitstekende gelegenheid geboden om endometriumbiologie te onderzoeken en de identificatie van groeifactoren en signaalroutes te vergemakkelijken die de vernieuwing en differentiatie van endometriumcellen regelen13,14. Methoden voor de isolatie en kweek van muizenslijmbeenweefsel worden beschreven in de literatuur en rapporteren het gebruik van verschillende enzymatische strategieën voor de isolatie van baarmoederepitheel voor het daaropvolgende kweken van endometriumepitheelorganoïden4. Terwijl eerdere literatuur een kritisch kader biedt voor endometriumepitheel organoïde cultuurprotocollen 4,5,6, biedt dit artikel een duidelijke, uitgebreide methode voor het genereren, onderhouden, verwerken en analyseren van deze organoïden. Standaardisatie van deze technieken is belangrijk voor het versnellen van de vooruitgang op het gebied van reproductieve biologie van vrouwen. Hier rapporteren we een gedetailleerde methodologie voor de enzymatische en mechanische zuivering van endometriumepitheelweefsel van muizen voor de daaropvolgende kweek van endometriumorganoïden in een gelmatrixsteiger. We beschrijven ook de methodologieën voor downstream histologische en moleculaire analyses van de gelmatrix-ingekapselde muis endometriumepitheel organoïden.
Hier beschrijven we methoden om endometriumepitheelorganoïden te genereren uit muizenslijmvlies en de protocollen die routinematig worden gebruikt voor hun downstream-analyse. Endometriumorganoïden zijn een krachtig hulpmiddel om de mechanismen te bestuderen die endometriumgerelateerde ziekten beheersen, zoals endometriose, endometriumkanker en implantatiefalen. Baanbrekende studies gepubliceerd in 2017 rapporteerden de omstandigheden om langdurige en hernieuwbare culturen van endometriumorganoïden uit muis en humaan …
The authors have nothing to disclose.
We bedanken Dr. Stephanie Pangas en Dr. Martin M. Matzuk (M.M.M.) voor het kritisch lezen en redigeren van ons manuscript. Studies werden ondersteund door Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development subsidies R00-HD096057 (D.M.), R01-HD105800 (D.M.), R01-HD032067 (M.M.M.) en R01-HD110038 (M.M.), en door NCI- P30 Cancer Center Support Grant (NCI-CA125123). Diana Monsivais, Ph.D. heeft een Next Gen Pregnancy Award van het Burroughs Wellcome Fund.
Organoid Media Formulation | |||
Name | Company | Catalog Number | Final concentration |
Corning Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix, *LDEV-free | Corning | 354230 | 100% |
Trypsin from Bovine Pancreas | Sigma Aldrich | T1426-1G | 1% |
Advanced DMEM/F12 | Life Technologies | 12634010 | 1X |
N2 supplement | Life Technologies | 17502048 | 1X |
B-27™ Supplement (50X), minus vitamin A | Life Technologies | 12587010 | 1X |
Primocin | Invivogen | ant-pm-1 | 100 µg/mL |
N-Acetyl-L-cysteine | Sigma Aldrich | A9165-5G | 1.25 mM |
L-glutamine | Life Technologies | 25030024 | 2 mM |
Nicotinamide | Sigma Aldrich | N0636-100G | 10 nM |
ALK-4, -5, -7 inhibitor, A83-01 | Tocris | 2939 | 500 nM |
Recombinant human EGF | Peprotech | AF-100-15 | 50 ng/mL |
Recombinant human Noggin | Peprotech | 120-10C | 100 ng/mL |
Recombinant human Rspondin-1 | Peprotech | 120-38 | 500 ng/mL |
Recombinant human FGF-10 | Peprotech | 100-26 | 100 ng/mL |
Recombinant human HGF | Peprotech | 100-39 | 50 ng/mL |
WNT3a | R&D systems | 5036-WN | 200 ng/mL |
Other supplies and reagents | |||
Name | Company | Catalog Number | Final concentration |
Collagenase from Clostridium histolyticum | Sigma Aldrich | C0130-1G | 5 mg/mL |
Deoxyribonuclease I from bovine pancreas | Sigma Aldrich | DN25-100MG | 2 mg/mL |
DPBS, no calcium, no magnesium | ThermoFisher | 14190-250 | 1X |
HBSS, no calcium, no magnesium | ThermoFisher | 14170112 | 1X |
Falcon Polystyrene Microplates (24-Well) | Fisher Scientific | #08-772-51 | |
Falcon Polystyrene Microplates (12-Well) | Fisher Scientific | #0877229 | |
Falcon Cell Strainers, 40 µm | Fisher Scientific | #08-771-1 | |
Direct-zol RNA MiniPrep (50 µg) | Genesee Scientific | 11-331 | |
Trizol reagent | Invitrogen | 15596026 | |
DMEM/F-12, HEPES, no phenol red | ThermoFisher | 11039021 | |
Fetal Bovine Serum, Charcoal stripped | Sigma Aldrich | F6765-500ML | 2% |
Estratiol (E2) | Sigma Aldrich | E1024-1G | 10 nM |
Formaldehyde 16% in aqueous solution, EM Grade | VWR | 15710 | 4% |
Epredia Cassette 1 Slotted Tissue Cassettes | Fisher Scientific | 1000961 | |
Epredia Stainless-Steel Embedding Base Molds | Fisher Scientific | 64-010-15 | |
Ethanol, 200 proof (100%) | Fisher Scientific | 22-032-601 | |
Histoclear | Fisher Scientific | 50-899-90147 | |
Permount Mounting Medium | Fisher Scientific | 50-277-97 | |
Epredia Nylon Biopsy Bags | Fisher Scientific | 6774010 | |
HistoGel Specimen Processing Gel | VWR | 83009-992 | |
Hematoxylin solution Premium | VWR | 95057-844 | |
Eosin Y (yellowish) solution Premium | VWR | 95057-848 | |
TBS Buffer, 20X, pH 7.4 | GenDEPORT | T8054 | 1X |
TBST (10X), pH 7.4 | GenDEPORT | T8056 | 1X |
Citric acid | Sigma Aldrich | C0759-1KG | |
Sodium citrate tribasic dihydrate | Sigma Aldrich | S4641-500G | |
Tween20 | Fisher Scientific | BP337-500 | |
Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma Aldrich | A2153-100G | 3% |
DAPI Solution (1 mg/mL) | ThermoFisher | 62248 | 1:1000 dilution |
VECTASHIELD Antifade Mounting Medium | Vector Labs | H-1000-10 | |
Clear Nail Polish | Fisher Scientific | NC1849418 | |
Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 22037246 | |
VWR Micro Cover Glasses | VWR | 48393-106 | |
SuperScript VILO Master Mix | ThermoFisher | 11755050 | |
SYBR Green PCR Master Mix | ThermoFisher | 4364346 | |
Krt8 Antibody (TROMA-I) | DSHB | TROMA-I | 1:50 dilution |
Vimentin Antobody | Cell Signaling | 5741S | 1:200 dilution |
Donkey anti-Rat IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 |
ThermoFisher | A-21209 | 1:250 dilution |
Donkey anti-Rabbin IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 |
ThermoFisher | A-21206 | 1:250 dilution |
ZEISS Stemi 508 Stereo Microscope | ZEISS | ||
ZEISS Axio Vert.A1 Inverted Routine Microscope with digital camera | ZEISS | ||
Primer Sequence | Forward (5'-3') | Reverse (5'-3') | _ |
Lipocalin 2 (Lcn2) | GCAGGTGGTACGTTGTGGG | CTCTTGTAGCTCATAGATGGTGC | |
Lactoferrin (Ltf) | TGAGGCCCTTGGACTCTGT | ACCCACTTTTCTCATCTCGTTC | |
Progesterone (Pgr) | CCCACAGGAGTTTGTCAAGCTC | TAACTTCAGACATCATTTCCGG | |
Glyceraldehyde 3 phosphate dehydrogenase (Gapdh) | CAATGTGTCCGTCGTGGATCT | GCCTGCTTCACCACCTTCTT |