JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biology

Fare Rahiminden 3D Endometriyal Organoidlerin Kurulması

Published: January 06, 2023
doi:
10.3791/64448
, , , , ,
1Department of Pathology & Immunology,Baylor College of Medicine, 2Center for Drug Discovery,Baylor College of Medicine, 3Departments of Molecular Virology and Microbiology and Medicine,Baylor College of Medicine

Summary

Bu protokol, gen ekspresyonu ve histolojik analizler için fare endometriyal epitel organoidlerini oluşturma metodolojilerini açıklamaktadır.

Abstract

Endometriyal doku uterusun iç boşluğunu kaplar ve östrojen ve progesteronun döngüsel kontrolü altındadır. Luminal ve glandüler epitel, stromal kompartman, vasküler ağ ve kompleks immün hücre popülasyonundan oluşan bir dokudur. Fare modelleri, endometriyumu incelemek için güçlü bir araç olmuştur ve implantasyonu, plasentasyonu ve kanseri kontrol eden kritik mekanizmaları ortaya çıkarmıştır. 3D endometriyal organoid kültürlerin son zamanlardaki gelişimi, endometriyal biyolojinin altında yatan sinyal yollarını incelemek için son teknoloji ürünü bir model sunmaktadır. Genetiği değiştirilmiş fare modellerinden endometriyal organoidler oluşturmak, transkriptomlarını analiz etmek ve morfolojilerini tek hücreli bir çözünürlükte görselleştirmek, endometriyal hastalıkların incelenmesi için çok önemli araçlardır. Bu makale, farelerden endometriyal epitelin 3D kültürlerini oluşturma yöntemlerini özetlemekte ve gen ekspresyonunu ölçmek ve organoidlerin histolojisini analiz etmek için teknikleri açıklamaktadır. Amaç, endometriyal epitel organoidlerinin gen ekspresyonunu ve morfolojik özelliklerini oluşturmak, kültürlemek ve incelemek için kullanılabilecek bir kaynak sağlamaktır.

Introduction

Endometriyum – uterus boşluğunun iç astar mukozal dokusu – bir kadının üreme sağlığında kritik rol oynayan benzersiz ve oldukça dinamik bir dokudur. Üreme ömrü boyunca, endometriyum, yumurtalık hormonlarının – östrojen ve progesteronun uyumlu etkisiyle koordine edilen yüzlerce proliferasyon, farklılaşma ve parçalanma döngüsüne girme potansiyeline sahiptir. Genetiği değiştirilmiş fareler üzerinde yapılan çalışmalar, hormonlara endometriyal yanıtı ve embriyo implantasyonunun, stromal hücre desidualizasyonunun ve gebeliğin kontrolünü destekleyen temel biyolojik mekanizmaları ortaya çıkarmıştır1. Bununla birlikte, in vitro çalışmalar, geleneksel 2D hücre kültürlerinde transforme edilmemiş primer fare endometriyal dokularının korunmasındaki zorluklar nedeniyle sınırlandırılmıştır 2,3. 3D organ sistemleri veya organoidler olarak endometriyal dokuların kültüründeki son gelişmeler, endometriyal hücre rejenerasyonunu ve farklılaşmasını kontrol eden biyolojik yolları araştırmak için yeni bir fırsat sunmaktadır. Fare ve insan endometriyal organoid sistemleri, çeşitli matrislerde kapsüllenmiş saf endometriyal epiteldengeliştirilmiştir 4,5, insan endometriyumu ise iskelesiz epitel / stromal ko-kültürler 6,7 ve daha yakın zamanda kollajen kapsüllü epitel / stromal assembloidler8 olarak kültürlenmiştir. . Epitelyal organoid kültürlerin büyüme ve rejeneratif potansiyeli, organoidlerin büyümesini ve rejenerasyonunu en üst düzeye çıkarmak için ampirik olarak belirlenmiş büyüme faktörleri ve küçük molekül inhibitörlerinin tanımlanmış bir kokteyli ile desteklenmektedir 4,5,9. Ayrıca, endometriyal organoidleri dondurma ve çözme yeteneği, endometriyal organoidlerin farelerden ve insanlardan gelecekteki çalışmalar için uzun vadeli bankacılığına izin verir.

Genetiği değiştirilmiş fareler, erken gebelik ve desidualizasyonu kontrol eden karmaşık sinyal yollarını ortaya çıkarmış ve gebelik kaybı, endometriyal kanser ve endometriozis modelleri olarak kullanılmıştır. Bu genetik çalışmalar, özellikle kadın üreme dokularında aktif olan cre rekombinazları kullanılarak loxP yan alellerinin (“floksed”) hücreye özgü delesyonuyla büyük ölçüde elde edilmiştir. Bu fare modelleri, endometriyal epitel ve stromal dokularda güçlü rekombinaz aktivitesine sahip olan yaygın olarak kullanılan progesteron reseptörü-cre10’u, yetişkin farelerde endometriyal epitel rekombinasyonunu indükleyen laktoferrin i-cre11’i veya Müllerian türevi dokularda epitelyal spesifik delesyonu tetikleyen Wnt7a-cre’yi içerir12 . Genetiği değiştirilmiş fare modellerinden endometriyal dokuların 3D organoidler olarak kültürlenmesi, endometriyal biyolojiyi araştırmak ve endometriyal hücre yenilenmesini ve farklılaşmasını kontrol eden büyüme faktörlerinin ve sinyal yollarının tanımlanmasını kolaylaştırmak için mükemmel bir fırsat sağlamıştır13,14. Literatürde fare endometriyal dokusunun izolasyonu ve kültürü için yöntemler tanımlanmış ve endometriyal epitel organoidlerinin daha sonraki kültürlenmesi için uterus epitelinin izolasyonu için çeşitli enzimatik stratejilerin kullanımı bildirilmiştir4. Önceki literatür endometriyal epitel organoid kültür protokolleri 4,5,6 için eleştirel bir çerçeve sağlarken, bu makale bu organoidlerin üretilmesi, sürdürülmesi, işlenmesi ve analiz edilmesi için açık ve kapsamlı bir yöntem sunmaktadır. Bu tekniklerin standardizasyonu, kadın üreme biyolojisi alanındaki ilerlemeleri hızlandırmak için önemlidir. Burada, bir jel matriks iskelesinde endometriyal organoidlerin sonraki kültürü için fare endometriyal epitel dokusunun enzimatik ve mekanik saflaştırılması için ayrıntılı bir metodoloji sunuyoruz. Ayrıca, jel matriks kapsüllü fare endometriyal epitel organoidlerinin aşağı akış histolojik ve moleküler analizleri için metodolojileri de açıklıyoruz.

Protocol

Fare kullanımı ve deneysel çalışmalar, Baylor College of Medicine Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC) tarafından onaylanan protokoller ve NIH Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu tarafından oluşturulan kılavuzlar kapsamında gerçekleştirilmiştir. 1. Uterus epitelinin enzimatik ve mekanik yöntemler kullanılarak farelerden izole edilmesi NOT: Bu bölümde, jel matris iskelesi kullanarak fareler…

Representative Results

Fare endometriyal organoidlerinin faz kontrast görüntüleriEkli protokolde açıklandığı gibi WT fare endometriyal epitelinden organoidler oluşturduk ( Şekil 1’deki şemaya bakınız). Fare endometriyal epitelinin enzimatik ayrışmasını takiben, epitel tabakaları uterus stromal hücrelerinden mekanik olarak ayrıldı ve tek hücreli bir süspansiyon oluşturmak için kollajenaz ile ayrıştı. Doğru yapılırsa, bu epitel ve stromal hücre ayırma yöntemi, k…

Discussion

Burada, fare endometriyumundan endometriyal epitel organoidleri üretme yöntemlerini ve bunların aşağı akış analizi için rutin olarak kullanılan protokolleri açıklıyoruz. Endometriyal organoidler, endometriozis, endometriyal kanser ve implantasyon başarısızlığı gibi endometriyal ilişkili hastalıkları kontrol eden mekanizmaları incelemek için güçlü bir araçtır. 2017 yılında yayınlanan dönüm noktası çalışmaları, fare ve insan epitelinden endometriyal organoidlerin uzun vadeli ve yenile…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dr. Stephanie Pangas ve Dr. Martin M. Matzuk’a (M.M.M.) makalemizin eleştirel okuması ve düzenlenmesi için teşekkür ederiz. Çalışmalar, Eunice Kennedy Shriver Ulusal Çocuk Sağlığı ve İnsani Gelişme Enstitüsü hibeleri R00-HD096057 (DM), R01-HD105800 (DM), R01-HD032067 (M.M.), ve R01-HD110038 (M.M.) ve NCI- P30 Kanser Merkezi Destek Hibesi (NCI-CA125123) tarafından desteklenmiştir. Diana Monsivais, Ph.D. Burroughs Wellcome Fund’dan Yeni Nesil Hamilelik Ödülü’ne sahiptir.

Materials

Organoid Media Formulation
Name Company Catalog Number Final concentration
Corning Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix, *LDEV-free Corning 354230 100%
Trypsin from Bovine Pancreas Sigma Aldrich T1426-1G 1%
Advanced DMEM/F12 Life Technologies 12634010 1X
N2 supplement Life Technologies 17502048 1X
B-27™ Supplement (50X), minus vitamin A Life Technologies 12587010 1X
Primocin Invivogen ant-pm-1 100 µg/mL
N-Acetyl-L-cysteine Sigma Aldrich A9165-5G 1.25 mM
L-glutamine Life Technologies 25030024 2 mM
Nicotinamide Sigma Aldrich N0636-100G 10 nM
ALK-4, -5, -7 inhibitor, A83-01 Tocris 2939 500 nM
Recombinant human EGF Peprotech AF-100-15 50 ng/mL
Recombinant human Noggin Peprotech 120-10C 100 ng/mL
Recombinant human Rspondin-1 Peprotech 120-38 500 ng/mL
Recombinant human FGF-10 Peprotech 100-26 100 ng/mL
Recombinant human HGF Peprotech 100-39 50 ng/mL
WNT3a R&D systems 5036-WN 200 ng/mL
Other supplies and reagents
Name Company Catalog Number Final concentration
Collagenase from Clostridium histolyticum Sigma Aldrich C0130-1G 5 mg/mL
Deoxyribonuclease I from bovine pancreas Sigma Aldrich DN25-100MG 2 mg/mL
DPBS, no calcium, no magnesium ThermoFisher 14190-250 1X
HBSS, no calcium, no magnesium ThermoFisher 14170112 1X
Falcon Polystyrene Microplates (24-Well) Fisher Scientific #08-772-51
Falcon Polystyrene Microplates (12-Well) Fisher Scientific #0877229
Falcon Cell Strainers, 40 µm Fisher Scientific #08-771-1
Direct-zol RNA MiniPrep (50 µg) Genesee Scientific 11-331
Trizol reagent Invitrogen 15596026
DMEM/F-12, HEPES, no phenol red ThermoFisher 11039021
Fetal Bovine Serum, Charcoal stripped Sigma Aldrich F6765-500ML 2%
Estratiol (E2) Sigma Aldrich E1024-1G 10 nM
Formaldehyde 16% in aqueous solution, EM Grade VWR 15710 4%
Epredia Cassette 1 Slotted Tissue Cassettes Fisher Scientific 1000961
Epredia Stainless-Steel Embedding Base Molds Fisher Scientific 64-010-15 
Ethanol, 200 proof (100%) Fisher Scientific 22-032-601 
Histoclear Fisher Scientific 50-899-90147
Permount Mounting Medium Fisher Scientific 50-277-97
Epredia Nylon Biopsy Bags Fisher Scientific 6774010
HistoGel Specimen Processing Gel VWR 83009-992
Hematoxylin solution Premium VWR 95057-844
Eosin Y (yellowish) solution Premium VWR 95057-848
TBS Buffer, 20X, pH 7.4 GenDEPORT T8054 1X
TBST (10X), pH 7.4 GenDEPORT T8056 1X
Citric acid  Sigma Aldrich C0759-1KG
Sodium citrate tribasic dihydrate Sigma Aldrich S4641-500G
Tween20 Fisher Scientific BP337-500 
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma Aldrich A2153-100G 3%
DAPI Solution (1 mg/mL) ThermoFisher 62248 1:1000 dilution
VECTASHIELD Antifade Mounting Medium Vector Labs H-1000-10
Clear Nail Polish Fisher Scientific NC1849418
Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides Fisher Scientific 22037246
VWR Micro Cover Glasses VWR 48393-106
SuperScript VILO Master Mix ThermoFisher 11755050
SYBR Green PCR Master Mix ThermoFisher 4364346
Krt8 Antibody (TROMA-I)  DSHB TROMA-I  1:50 dilution
Vimentin Antobody Cell Signaling 5741S 1:200 dilution
Donkey anti-Rat IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary
Antibody, Alexa Fluor 594		 ThermoFisher A-21209 1:250 dilution
Donkey anti-Rabbin IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary
Antibody, Alexa Fluor 488		 ThermoFisher A-21206 1:250 dilution
ZEISS Stemi 508 Stereo Microscope ZEISS
ZEISS Axio Vert.A1 Inverted Routine Microscope with digital camera ZEISS
Primer Sequence Forward (5'-3') Reverse (5'-3') _
Lipocalin 2 (Lcn2) GCAGGTGGTACGTTGTGGG CTCTTGTAGCTCATAGATGGTGC
Lactoferrin (Ltf) TGAGGCCCTTGGACTCTGT ACCCACTTTTCTCATCTCGTTC
Progesterone (Pgr) CCCACAGGAGTTTGTCAAGCTC TAACTTCAGACATCATTTCCGG
Glyceraldehyde 3 phosphate dehydrogenase (Gapdh) CAATGTGTCCGTCGTGGATCT GCCTGCTTCACCACCTTCTT
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wang, H., Dey, S. K. Roadmap to embryo implantation: clues from mouse models. Nature Reviews Genetics. 7 (3), 185-199 (2006).
  2. Hibaoui, Y., Feki, A. Organoid models of human endometrial development and disease. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 84 (2020).
  3. Rawlings, T. M., Makwana, K., Tryfonos, M., Lucas, E. S. Organoids to model the endometrium: implantation and beyond. Reproduction & Fertility. 2 (3), 85-101 (2021).
  4. Boretto, M., et al. Development of organoids from mouse and human endometrium showing endometrial epithelium physiology and long-term expandability. Development. 144 (10), 1775-1786 (2017).
  5. Turco, M. Y., et al. Long-term, hormone-responsive organoid cultures of human endometrium in a chemically defined medium. Nature Cell Biology. 19 (5), 568-577 (2017).
  6. Murphy, A. R., Wiwatpanit, T., Lu, Z., Davaadelger, B., Kim, J. J. Generation of multicellular human primary endometrial organoids. Journal of Visualized Experiments. (152), e60384 (2019).
  7. Wiwatpanit, T., et al. Scaffold-free endometrial organoids respond to excess androgens associated with polycystic ovarian syndrome. The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 105 (3), 769-780 (2020).
  8. Rawlings, T. M., et al. Modelling the impact of decidual senescence on embryo implantation in human endometrial assembloids. Elife. 10, 69603 (2021).
  9. Lou, L., Kong, S., Sun, Y., Zhang, Z., Wang, H. Human endometrial organoids: recent research progress and potential applications. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 10, 844623 (2022).
  10. Soyal, S. M., et al. Cre-mediated recombination in cell lineages that express the progesterone receptor. Genesis. 41 (2), 58-66 (2005).
  11. Daikoku, T., et al. Lactoferrin-iCre: a new mouse line to study uterine epithelial gene function. Endocrinology. 155 (7), 2718-2724 (2014).
  12. Winuthayanon, W., Hewitt, S. C., Orvis, G. D., Behringer, R. R., Korach, K. S. Uterine epithelial estrogen receptor alpha is dispensable for proliferation but essential for complete biological and biochemical responses. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (45), 19272-19277 (2010).
  13. Seishima, R., et al. Neonatal Wnt-dependent Lgr5 positive stem cells are essential for uterine gland development. Nature Communications. 10 (1), 5378 (2019).
  14. Syed, S. M., et al. Endometrial Axin2(+) cells drive epithelial homeostasis, regeneration, and cancer following oncogenic transformation. Cell Stem Cell. 26 (1), 64-80 (2020).
  15. Caligioni, C. S. Assessing reproductive status/stages in mice. Current Protocols in Neuroscience. , (2009).
  16. Fitzgerald, H. C., Schust, D. J., Spencer, T. E. In vitro models of the human endometrium: evolution and application for women’s health. Biology of Reproduction. 104 (2), 282-293 (2021).
  17. Hewitt, S. C., et al. Progesterone signaling in endometrial epithelial organoids. Cells. 11 (11), 1760 (2022).
  18. Sadeghipour, A., Babaheidarian, P. Making formalin-fixed, paraffin embedded blocks. Methods in Molecular Biology. 1897, 253-268 (2019).
  19. Qin, C., et al. The cutting and floating method for paraffin-embedded tissue for sectioning. Journal of Visualized Experiments. (139), e58288 (2018).
  20. Rekhtman, N., et al. Novel modification of HistoGel-based cell block preparation method: improved sufficiency for molecular studies. Archives of Pathology & Laboratory Medicine. 142 (4), 529-535 (2018).
  21. Shidham, V. B. CellBlockistry: Chemistry and art of cell-block making – A detailed review of various historical options with recent advances. Cytojournal. 16, 12 (2019).
  22. Ali, A., Syed, S. M., Tanwar, P. S. Protocol for in vitro establishment and long-term culture of mouse vaginal organoids. STAR Protocols. 1 (2), 100088 (2020).
  23. Kurihara, I., et al. COUP-TFII mediates progesterone regulation of uterine implantation by controlling ER activity. PLoS Genet. 3 (6), 102 (2007).
  24. McMaster, M. T., Teng, C. T., Dey, S. K., Andrews, G. K. Lactoferrin in the mouse uterus: analyses of the preimplantation period and regulation by ovarian steroids. Molecular Endocrinology. 6 (1), 101-111 (1992).
  25. Huang, H. L., Chu, S. T., Chen, Y. H. Ovarian steroids regulate 24p3 expression in mouse uterus during the natural estrous cycle and the preimplantation period. The Journal of Endocrinology. 162 (1), 11-19 (1999).
  26. Clevers, H. Modeling development and disease with organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
  27. Bigsby, R. M., Cunha, G. R. Estrogen stimulation of deoxyribonucleic acid synthesis in uterine epithelial cells which lack estrogen receptors. Endocrinology. 119 (1), 390-396 (1986).
  28. Clementi, C., et al. Activin-like kinase 2 functions in peri-implantation uterine signaling in mice and humans. PLoS Genetics. 9 (11), 1003863 (2013).
  29. Jeong, J. W., et al. Foxa2 is essential for mouse endometrial gland development and fertility. Biology of Reproduction. 83 (3), 396-403 (2010).
  30. Song, Y., et al. Endometriotic organoids: a novel in vitro model of endometriotic lesion development. bioRxiv. , (2022).
  31. Miyazaki, K., et al. Generation of progesterone-responsive endometrial stromal fibroblasts from human induced pluripotent stem cells: role of the WNT/CTNNB1 pathway. Stem Cell Reports. 11 (5), 1136-1155 (2018).
  32. Yoshimatsu, S., Kisu, I., Qian, E., Noce, T. A new horizon in reproductive research with pluripotent stem cells: successful in vitro gametogenesis in rodents, its application to large animals, and future in vitro reconstitution of reproductive organs such as "Uteroid" and "Oviductoid&#34. Biology. 11 (7), 987 (2022).
  33. Cheung, V. C., et al. Pluripotent stem cell-derived endometrial stromal fibroblasts in a cyclic, hormone-responsive, coculture model of human decidua. Cell Reports. 35 (7), 109138 (2021).
  34. McGowen, M. R., Erez, O., Romero, R., Wildman, D. E. The evolution of embryo implantation. The International Journal of Development Biology. 58 (2-4), 155-161 (2014).
  35. Carson, D. D., et al. Embryo implantation. Developmental Biology. 223 (2), 217-237 (2000).
  36. Li, Y., Sun, X., Dey, S. K. Entosis allows timely elimination of the luminal epithelial barrier for embryo implantation. Cell Reports. 11 (3), 358-365 (2015).
  37. Jain, V., Chodankar, R. R., Maybin, J. A., Critchley, H. O. D. Uterine bleeding: how understanding endometrial physiology underpins menstrual health. Nature Reviews Endocrinology. 18 (5), 290-308 (2022).
  38. Hayashi, K., et al. Wnt genes in the mouse uterus: potential regulation of implantation. Biology of Reproduction. 80 (5), 989-1000 (2009).
  39. Dunlap, K. A., et al. Postnatal deletion of Wnt7a inhibits uterine gland morphogenesis and compromises adult fertility in mice. Biology of Reproduction. 85 (2), 386-396 (2011).
  40. Ter Steege, E. J., Bakker, E. R. M. The role of R-spondin proteins in cancer biology. Oncogene. 40 (47), 6469-6478 (2021).
  41. Brazil, D. P., Church, R. H., Surae, S., Godson, C., Martin, F. BMP signalling: agony and antagony in the family. Trends in Cell Biology. 25 (5), 249-264 (2015).
  42. Tojo, M., et al. The ALK-5 inhibitor A-83-01 inhibits Smad signaling and epithelial-to-mesenchymal transition by transforming growth factor-beta. Cancer Science. 96 (11), 791-800 (2005).
  43. Zhang, Y., Que, J. BMP signaling in development, stem cells, and diseases of the gastrointestinal tract. Annual Review of Physiology. 82, 251-273 (2020).
  44. Plikus, M. V., et al. Cyclic dermal BMP signalling regulates stem cell activation during hair regeneration. Nature. 451 (7176), 340-344 (2008).
  45. Gurung, S., Werkmeister, J. A., Gargett, C. E. Inhibition of transforming growth factor-β receptor signaling promotes culture expansion of undifferentiated human endometrial mesenchymal stem/stromal cells. Scientific Reports. 5, 15042 (2015).
  46. Lucciola, R., et al. Impact of sustained transforming growth factor-β receptor inhibition on chromatin accessibility and gene expression in cultured human endometrial MSC. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 567610 (2020).
  47. Hernandez-Gordillo, V., et al. Fully synthetic matrices for in vitro culture of primary human intestinal enteroids and endometrial organoids. Biomaterials. 254, 120125 (2020).
  48. Gnecco, J. S., et al. Physiomimetic Models of Adenomyosis. Seminars in Reproductive Medicine. 38 (2-03), 179-196 (2020).
  49. Nikolakopoulou, K., Turco, M. Y. Investigation of infertility using endometrial organoids. Reproduction. 161 (5), 113-127 (2021).
  50. Kim, J. J. Preparing for implantation. Elife. 10, 73739 (2021).

Tags

3D Endometrial OrganoidsMouse UterusUterine EpitheliumEnzymatic DissociationMechanical DissociationCell CultureOrganoid EstablishmentCell PelletCollagenaseDNA Solution
check_url/64448?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Tang, S., Parks, S. E., Liao, Z., Cope, D. I., Blutt, S. E., Monsivais, D. Establishing 3D Endometrial Organoids from the Mouse Uterus. J. Vis. Exp. (191), e64448, doi:10.3791/64448 (2023).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image