Etablering av 3D Endometrial Organoids fra Mouse Uterus

Summary

Denne protokollen beskriver metoder for å etablere endometrielle organoider for museepitelorganer for genuttrykk og histologiske analyser.

Abstract

Endometrial vev linjer det indre hulrommet i livmoren og er under syklisk kontroll av østrogen og progesteron. Det er et vev som består av luminal- og kjertelepitel, et stromalt rom, et vaskulært nettverk og en kompleks immuncellepopulasjon. Musemodeller har vært et kraftig verktøy for å studere endometrium, og avslører kritiske mekanismer som styrer implantasjon, placentasjon og kreft. Den nylige utviklingen av 3D endometrial organoid kulturer presenterer en state-of-the-art modell for å dissekere signalveiene som ligger til grunn for endometrisk biologi. Etablering av endometrieorganoider fra genetisk utviklede musemodeller, analyse av transkriptomer og visualisering av morfologi ved encellet oppløsning er avgjørende verktøy for studiet av endometriesykdommer. Dette papiret skisserer metoder for å etablere 3D-kulturer av endometrisk epitel fra mus og beskriver teknikker for å kvantifisere genuttrykk og analysere organoidens histologi. Målet er å gi en ressurs som kan brukes til å etablere, dyrke og studere genuttrykk og morfologiske egenskaper av endometrielle epitelorganoider.

Introduction

Endometrium – det indre slimhinnen i livmorhulen – er et unikt og svært dynamisk vev som spiller kritiske roller i en kvinnes reproduktive helse. Under reproduktiv levetid har endometrium potensialet til å gjennomgå hundrevis av sykluser av spredning, differensiering og sammenbrudd, koordinert av den samordnede virkningen av eggstokkhormonene – østrogen og progesteron. Studier av genmodifiserte mus har avdekket grunnleggende biologiske mekanismer som ligger til grunn for endometrieresponsen på hormoner og kontroll av embryoimplantasjon, stromalcelledecidualisering og graviditet¹. In vitro-studier har imidlertid vært begrenset på grunn av vanskeligheter med å opprettholde ikke-transformert primært museendometrievev i tradisjonelle 2D-cellekulturer ^2,3. Nylige fremskritt i kulturen av endometrievev som 3D-organsystemer, eller organoider, presenterer en ny mulighet til å undersøke biologiske veier som styrer endometriecelleregenerering og differensiering. Mus og humane endometriske organoidsystemer er utviklet fra rent endometrieepitel innkapslet i forskjellige matriser^4,5, mens humant endometrium har blitt dyrket som stillasfrie epitel-/stromale kokulturer^6,7, og mer nylig som kollageninnkapslede epitelial/stromale assembloider⁸ . Veksten og det regenerative potensialet til epitelorganoidkulturer støttes av en definert cocktail av vekstfaktorer og små molekylhemmere som er empirisk bestemt for å maksimere vekst og regenerering av organoidene ^4,5,9. Videre tillater evnen til å fryse og tine endometrieorganoider den langsiktige banken av endometrieorganoider fra mus og mennesker for fremtidige studier.

Genmodifiserte mus har avslørt de komplekse signalveiene som styrer tidlig graviditet og decidualisering, og har blitt brukt som modeller for graviditetstap, endometriekreft og endometriose. Disse genetiske studiene er i stor grad oppnådd med cellespesifikk delesjon av loxP-flankerte alleler (“floxed”) ved bruk av cre recombinaser som er spesielt aktive i kvinnelig reproduktivt vev. Disse musemodellene inkluderer den mye brukte progesteronreseptor-cre¹⁰, som har sterk rekombinaseaktivitet i endometrieepitel- og stromalvevet, laktoferrin i-cre, som induserer endometrisk epitelrekombinasjon hos voksne mus¹¹, eller Wnt7a-cre, som utløser epitelspesifikk delesjon i Müllerian-avledet vev¹² . Dyrking av endometrievev fra genetisk utviklede musemodeller som 3D-organoider har gitt en utmerket mulighet til å undersøke endometrisk biologi og lette identifisering av vekstfaktorer og signalveier som styrer endometriecellefornyelse og differensiering^13,14. Metoder for isolering og kultur av mus endometrievev er beskrevet i litteraturen og rapporterer bruken av ulike enzymatiske strategier for isolering av livmorepitel for etterfølgende dyrking av endometriske epitelorganoider⁴. Mens tidligere litteratur gir et kritisk rammeverk for endometrieepitelorganoidkulturprotokoller ^4,5,6, gir dette papiret en klar, omfattende metode for å generere^, vedlikeholde, behandle og analysere disse organoider. Standardisering av disse teknikkene er viktig for å akselerere fremskritt innen kvinners reproduktive biologi. Her rapporterer vi en detaljert metodikk for enzymatisk og mekanisk rensing av mus endometrial epitelvev for den etterfølgende kulturen av endometrieorganoider i et gelmatrisestillas. Vi beskriver også metodene for nedstrøms histologiske og molekylære analyser av gelmatrise-innkapslede mus endometrial epitelorganoider.

Protocol

Musehåndtering og eksperimentelle studier ble utført under protokoller godkjent av Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) fra Baylor College of Medicine og retningslinjer fastsatt av NIH Guide for Care and Use of Laboratory Animals. 1. Isolering av livmorepitel fra mus ved hjelp av enzymatiske og mekaniske metoder MERK: Denne delen beskriver trinnene som kreves for å etablere, passere, fryse og tine epiteliale endometrieorganoider fra …

Representative Results

Fasekontrastbilder av musens endometrieorganoiderVi etablerte organoider fra WT-mus endometrisk epitel, som beskrevet i vedlagte protokoll (se figur 1). Etter enzymatisk dissosiasjon av musens endometrieepitel ble epitelarkene mekanisk separert fra livmorstromalcellene og videre dissosiert med kollagenase for å generere en encellet suspensjon. Hvis det utføres riktig, bør denne metoden for epitel- og stromalcelleseparasjon gi prøver med forurensning på ikke mer enn …

Discussion

Her beskriver vi metoder for å generere endometrielle epitelorganoider fra musens endometrium og protokollene som rutinemessig brukes til nedstrømsanalyse. Endometrieorganoider er et kraftig verktøy for å studere mekanismene som kontrollerer endometrierelaterte sykdommer, som endometriose, endometriekreft og implantasjonssvikt. Landemerkestudier publisert i 2017 rapporterte forholdene til å dyrke langsiktige og fornybare kulturer av endometrieorganoider fra mus og humant epitel ^4,5…

Materials

Organoid Media Formulation
Name	Company	Catalog Number	Final concentration
Corning Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix, *LDEV-free	Corning	354230	100%
Trypsin from Bovine Pancreas	Sigma Aldrich	T1426-1G	1%
Advanced DMEM/F12	Life Technologies	12634010	1X
N2 supplement	Life Technologies	17502048	1X
B-27™ Supplement (50X), minus vitamin A	Life Technologies	12587010	1X
Primocin	Invivogen	ant-pm-1	100 µg/mL
N-Acetyl-L-cysteine	Sigma Aldrich	A9165-5G	1.25 mM
L-glutamine	Life Technologies	25030024	2 mM
Nicotinamide	Sigma Aldrich	N0636-100G	10 nM
ALK-4, -5, -7 inhibitor, A83-01	Tocris	2939	500 nM
Recombinant human EGF	Peprotech	AF-100-15	50 ng/mL
Recombinant human Noggin	Peprotech	120-10C	100 ng/mL
Recombinant human Rspondin-1	Peprotech	120-38	500 ng/mL
Recombinant human FGF-10	Peprotech	100-26	100 ng/mL
Recombinant human HGF	Peprotech	100-39	50 ng/mL
WNT3a	R&D systems	5036-WN	200 ng/mL
Other supplies and reagents
Name	Company	Catalog Number	Final concentration
Collagenase from Clostridium histolyticum	Sigma Aldrich	C0130-1G	5 mg/mL
Deoxyribonuclease I from bovine pancreas	Sigma Aldrich	DN25-100MG	2 mg/mL
DPBS, no calcium, no magnesium	ThermoFisher	14190-250	1X
HBSS, no calcium, no magnesium	ThermoFisher	14170112	1X
Falcon Polystyrene Microplates (24-Well)	Fisher Scientific	#08-772-51
Falcon Polystyrene Microplates (12-Well)	Fisher Scientific	#0877229
Falcon Cell Strainers, 40 µm	Fisher Scientific	#08-771-1
Direct-zol RNA MiniPrep (50 µg)	Genesee Scientific	11-331
Trizol reagent	Invitrogen	15596026
DMEM/F-12, HEPES, no phenol red	ThermoFisher	11039021
Fetal Bovine Serum, Charcoal stripped	Sigma Aldrich	F6765-500ML	2%
Estratiol (E2)	Sigma Aldrich	E1024-1G	10 nM
Formaldehyde 16% in aqueous solution, EM Grade	VWR	15710	4%
Epredia Cassette 1 Slotted Tissue Cassettes	Fisher Scientific	1000961
Epredia Stainless-Steel Embedding Base Molds	Fisher Scientific	64-010-15
Ethanol, 200 proof (100%)	Fisher Scientific	22-032-601
Histoclear	Fisher Scientific	50-899-90147
Permount Mounting Medium	Fisher Scientific	50-277-97
Epredia Nylon Biopsy Bags	Fisher Scientific	6774010
HistoGel Specimen Processing Gel	VWR	83009-992
Hematoxylin solution Premium	VWR	95057-844
Eosin Y (yellowish) solution Premium	VWR	95057-848
TBS Buffer, 20X, pH 7.4	GenDEPORT	T8054	1X
TBST (10X), pH 7.4	GenDEPORT	T8056	1X
Citric acid	Sigma Aldrich	C0759-1KG
Sodium citrate tribasic dihydrate	Sigma Aldrich	S4641-500G
Tween20	Fisher Scientific	BP337-500
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma Aldrich	A2153-100G	3%
DAPI Solution (1 mg/mL)	ThermoFisher	62248	1:1000 dilution
VECTASHIELD Antifade Mounting Medium	Vector Labs	H-1000-10
Clear Nail Polish	Fisher Scientific	NC1849418
Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides	Fisher Scientific	22037246
VWR Micro Cover Glasses	VWR	48393-106
SuperScript VILO Master Mix	ThermoFisher	11755050
SYBR Green PCR Master Mix	ThermoFisher	4364346
Krt8 Antibody (TROMA-I)	DSHB	TROMA-I	1:50 dilution
Vimentin Antobody	Cell Signaling	5741S	1:200 dilution
Donkey anti-Rat IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 594	ThermoFisher	A-21209	1:250 dilution
Donkey anti-Rabbin IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488	ThermoFisher	A-21206	1:250 dilution
ZEISS Stemi 508 Stereo Microscope	ZEISS
ZEISS Axio Vert.A1 Inverted Routine Microscope with digital camera	ZEISS
Primer Sequence	Forward (5'-3')	Reverse (5'-3')	_
Lipocalin 2 (Lcn2)	GCAGGTGGTACGTTGTGGG	CTCTTGTAGCTCATAGATGGTGC
Lactoferrin (Ltf)	TGAGGCCCTTGGACTCTGT	ACCCACTTTTCTCATCTCGTTC
Progesterone (Pgr)	CCCACAGGAGTTTGTCAAGCTC	TAACTTCAGACATCATTTCCGG
Glyceraldehyde 3 phosphate dehydrogenase (Gapdh)	CAATGTGTCCGTCGTGGATCT	GCCTGCTTCACCACCTTCTT