Infraröd termografi för detektion av förändringar i brun fettvävnadsaktivitet

Summary

Här presenterar vi ett protokoll för mätning av brun fettvävnadsaktivitet efter en måltid hos människor och försöksdjur.

Abstract

Mätning av brun fettvävnadsaktivitet (BAT) genom positronemissionstomografi datortomografi (PET-CT) via ackumulering av ¹⁸F-fluorodeoxiglukos (FDG) efter en måltid eller hos överviktiga eller diabetiska patienter misslyckas som valmetod. Huvudorsaken är att ¹⁸F-FDG konkurrerar med den postprandiella höga glukosplasmakoncentrationen om samma glukostransportör på BAT-cellernas membran. Dessutom använder BAT fettsyror som energikälla, vilket inte syns med PET-CT och kan ändras tillsammans med glukoskoncentrationen hos överviktiga och diabetiska patienter. För att uppskatta den fysiologiska betydelsen av BAT hos djur och människor används därför en ny infraröd termografimetod som används i senare publikationer.

Efter fasta över natten mättes BAT-aktiviteten med infraröd termografi före och efter en måltid hos frivilliga försökspersoner och honmöss av vildtyp. Kameraprogramvaran beräknar objektets temperatur med hjälp av avstånd från objektet, hudens emissivitet, reflekterad rumstemperatur, lufttemperatur och relativ luftfuktighet. Hos möss var det rakade området ovanför BAT ett intressant område för vilket genomsnittliga och maximala temperaturer mättes. Fasen av estrouscykeln hos kvinnliga möss bestämdes efter ett experiment med vaginala utstryk färgade med kresylviolett (0,1%) fläcklösning. Hos friska frivilliga valdes två hudområden i nacken: det supraklavikulära området (ovanför nyckelbenet, där BAT-celler finns) och det interklavikulära området (mellan nyckelbenen, där ingen BAT-vävnad detekteras). BAT-aktiviteten bestäms av subtraktionen av dessa två värden. Dessutom kan de genomsnittliga och maximala temperaturerna i hudområden bestämmas hos djur och mänskliga deltagare.

Förändringar i BAT-aktivitet efter en måltid mätt med infraröd termografi, en icke-invasiv och känsligare metod, visade sig vara beroende av kön, ålder och fas i brunstcykeln hos försöksdjur. Som en del av kostinducerad termogenes har BAT-aktivering hos människor också visat sig vara beroende av kön, ålder och kroppsmassindex. Ytterligare bestämning av patofysiologiska förändringar i BAT-aktivitet efter en måltid kommer att vara av stor betydelse för deltagare med höga plasmakoncentrationer av glukos (fetma och diabetes mellitus typ 2), liksom hos olika försöksdjur (knock-out-möss). Denna metod är också ett variabelt verktyg för att bestämma möjliga aktiverande läkemedel som kan föryngra BAT-aktiviteten.

Introduction

Brun fettvävnad (BAT), i motsats till vit fettvävnad (WAT), lagrar inte utan spenderar snarare energi. Vid sympatisk stimulering använder BAT fettsyror och glukos och producerar värme genom aktivering av frikopplingsprotein 1 (UCP1). UCP1: s funktion är att använda en H ⁺ gradient mellan två mitokondriella membran för att producera värme istället för ATP. BAT:s funktion är att öka värmeproduktionen under kalla förhållanden, vilket leder till en ökning av energiförbrukningen¹. Efter kall exponering hämmar sensoriska ingångar från huden värmekänsliga neuroner i median preoptisk (MnPO) kärna i det hypotalamiska preoptiska området (POA), vilket minskar den hämmande effekten av POA-neuroner på rostral raphe pallidus (rRPa). Aktiveringen av rRPa-neuroner ökar den sympatiska aktiviteten, vilket följs av en ökning av BAT-aktiviteten ^2,3. Kallinducerad BAT-aktivering förbättrar insulinkänsligheten hos människa⁴, och denna aktivitet minskar hos människor med ökat kroppsmasseindex (BMI) och ålder 1,5,6,7.

Bortsett från dess roll i kallinducerad termogenes, efter en måltid, ökar glukosupptaget i BAT i den magra manliga befolkningen, vilket bidrar till dietinducerad termogenes (DIT), vilket är högre hos BAT-positiva manliga försökspersoner ^8,9. Den senaste tekniken som används för att mäta BAT-aktivitet är datortomografi med positronemissionstomografi, känd som PET-CT. Denna metod bestämmer BAT-aktiviteten genom att mäta ackumuleringen av radiotracern fluorodeoxiglukos (¹⁸F-FDG). PET-CT fungerar dock inte som val av metod för att detektera aktivering av BAT efter en måltid. En av anledningarna är att ¹⁸F-FDG efter en måltid konkurrerar med postprandial hyperglykemi om samma glukostransportör, vilket gör den olämplig för att bestämma BAT-aktivering efter en måltid, särskilt vid jämförelse av BAT-aktivitet hos friska och diabetiska deltagare med möjliga skillnader i blodsockerkoncentrationer. BAT använder dessutom fettsyror som energikälla för värmeproduktion, vilket inte syns med PET-CT. ¹⁸ F-FDG-ackumulering i BAT efter en måltid är knappt synlig¹⁰ och tolkas därför som ett negativt resultat i de flesta fall. Föga förvånande föreslogs det nyligen att aktiveringen av BAT är mer uttalad i den mänskliga populationen än vi tidigare trott. Därför är det nödvändigt med en ny metod för att upptäcka BAT-aktivitet och dess inblandning i metaboliska störningar⁷. Ett försök att lösa detta problem är att mäta volymen BAT med magnetisk resonanstomografi (MRT) hos prediabetiker och patienter med diabetes mellitus typ 2 (T2DM) med insulinresistens¹¹. BAT-volymen mätt med MRT är dock inte en tillräcklig indikator för att uppskatta den dagliga funktionen och användningen av glukos och fettsyror med BAT. För att uppskatta verkliga skillnader i BAT-aktivitet hos friska jämfört med T2DM-patienter behövs därför ett nytt tillvägagångssätt som ger möjlighet att ta reda på den patologiska mekanismen för BAT-funktionsfel hos T2DM-patienter.

För att bestämma aktiveringen av BAT utförde vi mätningar av BAT-värmeproduktionen före och efter en måltid med infraröd (IR) termografi (figur 1)^12,13. Att etablera IR-termografi som en metod för att mäta BAT-aktivitet efter en måltid hos friska och feta individer eller patienter med diabetes mellitus kommer att ha en enorm inverkan på fältet. Än idag används IR-termografi för bestämning av kallinducerad aktivering av BAT^13,14,15. Under senare tid i mänskligheten är den kallinducerade BAT-aktiviteten inte särskilt uttalad längre (på grund av korrekt uppvärmning av livsmiljöer, lämpliga kläder), medan BAT-aktivering efter en måltid sker varje dag. Dessutom är den fysiologiska regleringen av dessa två BAT-funktioner via hypotalamus helt annorlunda. Efter en måltid leder aktiveringen av proopiomelanokortin (POMC)-uttryckande neuroner i den hypotalamiska bågformiga kärnan (Arc) till en ökning av sympatisk nervaktivitet via rRPa¹⁶. Kallinducerad aktivering av BAT mätt med IR-termografi eller PET-CT är felaktig när den används som ett mått för daglig BAT-aktivitet. Ökad BAT-aktivitet efter en måltid följs av glukosutnyttjande, vilket i slutändan är viktigt för att upprätthålla glukoshomeostas, insulinkänslighet och den dagliga regleringen av glukoskoncentrationen. Postprandial BAT-aktivering leder till en ökning av postprandial glukosförbrukning, följt av en ökning av värmeproduktion och kroppstemperatur (DIT). Detta visade sig vara kön, ålder och BMI-beroende¹². Liknande könsskillnader i BAT-aktivering efter måltid observeras hos han- och honlaboratoriemöss¹⁷. Dessa fynd motsvarar nyligen upptäckta könsskillnader i regleringen av BAT av Burke et al., som visade att den hypotalamiska regleringen av BAT browning via en subpopulation av POMC-neuroner skiljer sig åt hos manliga och kvinnliga möss¹⁸. Den postprandiella aktiveringen av BAT är mindre hos kvinnor, äldre populationer och feta personer. Avsaknad av BAT-aktivering efter måltid (minskat glukosutnyttjande) kan leda till en högre prevalens av nedsatt glukostolerans hos kvinnor 19,20,21,22. Tyvärr gjordes majoriteten av studierna om BAT-aktivering endast på män. Genom att aktivera BAT efter en måltid ökar glukosupptaget i den magra manliga populationen. Det är inte förvånande att DIT efter BAT-aktivering är högre hos BAT-positiva manliga försökspersoner ^8,9. Dessutom förbättrar BAT-transplantation hos hanmöss glukostoleransen, ökar insulinkänsligheten och minskar kroppsvikt och fettmassa²³.

PET-CT misslyckas som en valfri metod för att mäta BAT-aktivitet, särskilt efter en måltid. Därför utvecklades en icke-invasiv och känsligare metod. IR-termografi möjliggör uppskattning av BAT-aktivitet hos olika försöksdjur (knock-out-möss) och hos människor, oavsett kön, ålder eller effekterna av olika patologiska tillstånd på BAT-aktiviteten. En ytterligare fördel med denna metod är enkelheten för deltagare och försöksdjur, vilket gör att vi kan uppskatta de potentiella fördelarna med BAT-boosterbehandling. De nyligen genomförda studierna med IR-termografi för att bestämma det fysiologiska beteendet hos BAT efter kall exponering eller en måltid beskrivs i den senaste publikationen av Brasil et ^al.24.

Protocol

Alla försök på försöksdjur har godkänts av den nationella etikkommittén och jordbruksministeriet (EP 185/2018). Experimenten utfördes i enlighet med den etiska kodexen från det kroatiska samhället för försöksdjursvetenskap och ARRIVE-riktlinjerna. Alla procedurer som utfördes i studier med mänskliga deltagare var i enlighet med Helsingforsdeklarationen och godkänd av etikkommittén vid universitetet i Zagreb, School of Medicine (UP/I-322-01/18-01/56). I denna studie presenterar vi resultaten från tre kvi…

Representative Results

Det enklaste sättet att fastställa BAT-aktivitet är att subtrahera den maximala hudtemperaturen över BAT före och efter en måltid hos försökspersoner. Ett bättre sätt att beräkna BAT-aktivitet är att välja två intressanta regioner: hudområdet ovanför BAT, som ligger i det supraklavikulära området, och det interklavikulära området i huden där ingen BAT-vävnad finns hos människor, som betecknas som referensområde (enligt PET-CT; Figur 1). BAT-aktiviteten bestäms sedan …

Discussion

Nya studier presenterar växande bevis för den fysiologiska regleringen och betydelsen av BAT-aktivitet hos vuxna människor och djur vid utveckling av fetma och diabetes mellitus. Dessutom håller möjlig BAT-aktivering av exogena aktivatorer på att bli ett mål för läkemedelsföretag. För att kunna uppskatta den fysiologiska regleringen och patofysiologiska betydelsen av BAT vid mycket betungande sjukdomar, samt upptäcka ett potentiellt terapeutiskt tillvägagångssätt, blir infraröd termografi den metod som va…

Materials

0.1% cresyl violet acetate	Commonly used chemical
Device for measuring air temperature and humidity	Kesterl	Kestrel 4200	Certificat of conformity
External data storage	Hard Drive with at least 1 TB
Glass microscopic slides	Commonly used
Small cotton tip swab	Urethral swabs
Software for analysis	FLIR Systems, Wilsonville, OR, USA	FLIR Tools
Software for meassurements	FLIR Systems, Wilsonville, OR, USA	ResearchIR software	FLIR ResearchIR Max, version 4.40.12.38 (64-bit)
Thermac Camera	FLIR Systems, Wilsonville, OR, USA	FLIR T-1020