Infrarot-Thermografie zur Detektion von Veränderungen der Aktivität des braunen Fettgewebes

Summary

In dieser Arbeit stellen wir ein Protokoll zur Messung der Aktivität von braunem Fettgewebe nach einer Mahlzeit bei Menschen und Versuchstieren vor.

Abstract

Die Messung der Aktivität des braunen Fettgewebes (BAT) mittels Positronen-Emissions-Tomographie, Computertomographie (PET-CT) über die Akkumulation von ¹⁸F-Fluorodeoxyglukose (FDG) nach einer Mahlzeit oder bei adipösen oder diabetischen Patienten versagt als Methode der Wahl. Der Hauptgrund dafür ist, dass ¹⁸F-FDG mit der postprandialen hohen Glukoseplasmakonzentration um den gleichen Glukosetransporter auf der Membran von BAT-Zellen konkurriert. Darüber hinaus nutzt BAT auch Fettsäuren als Energiequelle, was bei PET-CT nicht sichtbar ist und bei adipösen und diabetischen Patienten zusammen mit der Glukosekonzentration verändert werden kann. Um die physiologische Bedeutung von BVT bei Tier und Mensch abzuschätzen, wird daher ein neues Infrarot-Thermografieverfahren angewendet, das in neueren Publikationen verwendet wird.

Nach dem nächtlichen Fasten wurde die BAT-Aktivität mittels Infrarot-Thermografie vor und nach einer Mahlzeit bei Probanden und weiblichen Wildtyp-Mäusen gemessen. Die Kamerasoftware berechnet die Temperatur des Objekts anhand des Abstands zum Objekt, des Emissionsgrades der Haut, der reflektierten Raumtemperatur, der Lufttemperatur und der relativen Luftfeuchtigkeit. Bei Mäusen war der rasierte Bereich oberhalb der BAT eine Region von Interesse, für die Durchschnitts- und Maximaltemperaturen gemessen wurden. Die Phase des Brunstzyklus bei weiblichen Mäusen wurde nach einem Experiment durch Vaginalausstriche bestimmt, die mit Kresylviolett (0,1%) Färbelösung gefärbt wurden. Bei gesunden Probanden wurden zwei Hautbereiche des Halses ausgewählt: der supraklavikuläre Bereich (oberhalb des Schlüsselbeins, wo BAT-Zellen vorhanden sind) und der interklavikuläre Bereich (zwischen den Schlüsselbeinen, wo kein BAT-Gewebe nachgewiesen werden kann). Die BVT-Aktivität wird durch die Subtraktion dieser beiden Werte bestimmt. Auch die durchschnittliche und maximale Temperatur von Hautarealen konnte bei Tieren und Menschen bestimmt werden.

Es konnte gezeigt werden, dass Veränderungen der BVT-Aktivität nach einer Mahlzeit, die mittels Infrarot-Thermografie, einer nicht-invasiven und sensitiveren Methode, gemessen wurden, bei Labortieren von Geschlecht, Alter und Phase des Brunstzyklus abhängen. Im Rahmen der ernährungsinduzierten Thermogenese ist die BAT-Aktivierung beim Menschen auch nachweislich geschlechts-, alters- und body-mass-index-abhängig. Die weitere Bestimmung der pathophysiologischen Veränderungen der BAT-Aktivität nach einer Mahlzeit wird für Teilnehmer mit hohen Glukoseplasmakonzentrationen (Adipositas und Diabetes mellitus Typ 2) sowie bei verschiedenen Versuchstieren (Knock-out-Mäuse) von großer Bedeutung sein. Diese Methode ist auch ein variables Werkzeug, um mögliche aktivierende Medikamente zu bestimmen, die die BAT-Aktivität verjüngen könnten.

Introduction

Braunes Fettgewebe (BAT) speichert im Gegensatz zu weißem Fettgewebe (WAT) nicht, sondern verbraucht Energie. Bei sympathischer Stimulation nutzt BAT Fettsäuren und Glukose und erzeugt Wärme durch die Aktivierung des Entkopplungsproteins 1 (UCP1). Die Funktion von UCP1 besteht darin, einen H^+-Gradienten zwischen zwei mitochondrialen Membranen zu nutzen, um Wärme anstelle von ATP zu erzeugen. Die BVT hat die Funktion, die Wärmeerzeugung unter kalten Bedingungen zu erhöhen, was zu einem Anstieg des Energieverbrauchs^{führt 1}. Nach Kälteexposition hemmen sensorische Inputs der Haut wärmeempfindliche Neuronen im Nucleus median präoptischer (MnPO) des hypothalamischen präoptischen Bereichs (POA), was die hemmende Wirkung von POA-Neuronen auf den rostralen Raphe pallidus (rRPa) verringert. Die Aktivierung von rRPa-Neuronen erhöht die sympathische Aktivität, worauf eine Erhöhung der BAT-Aktivität folgt ^2,3. Die kälteinduzierte BAT-Aktivierung verbessert die Insulinsensitivität beim Menschen⁴, und diese Aktivität ist bei Menschen mit erhöhtem Body-Mass-Index (BMI) und Alter 1,5,6,7 verringert.

Abgesehen von seiner Rolle bei der kälteinduzierten Thermogenese nimmt die Glukoseaufnahme im BAT nach einer Mahlzeit in der mageren männlichen Bevölkerung zu, was zur ernährungsinduzierten Thermogenese (DIT) beiträgt, die bei BVT-positiven männlichen Probanden höher ist ^8,9. Das modernste Verfahren zur Messung der BAT-Aktivität ist die Positronen-Emissions-Tomographie-Computertomographie, bekannt als PET-CT. Diese Methode bestimmt die BAT-Aktivität durch Messung der Akkumulation des Radiotracers Fluordesoxyglucose (¹⁸F-FDG). Die PET-CT ist jedoch nicht die Methode der Wahl, um die Aktivierung von BAT nach einer Mahlzeit nachzuweisen. Einer der Gründe dafür ist, dass ¹⁸F-FDG nach einer Mahlzeit mit der postprandialen Hyperglykämie um denselben Glukosetransporter konkurriert, was es für die Bestimmung der BAT-Aktivierung nach einer Mahlzeit ungeeignet macht, insbesondere wenn die BAT-Aktivität bei gesunden und diabetischen Teilnehmern mit möglichen Unterschieden in der Blutzuckerkonzentration verglichen wird. Darüber hinaus nutzt BAT Fettsäuren als Energiequelle für die Wärmeerzeugung, die bei PET-CT nicht sichtbar ist. ¹⁸. Sonstiges Die F-FDG-Akkumulation in BVT nach einer Mahlzeit ist kaum sichtbar¹⁰ und wird daher in den meisten Fällen als negatives Ergebnis interpretiert. Es überrascht nicht, dass kürzlich vermutet wurde, dass die Aktivierung von BAT in der menschlichen Bevölkerung stärker ausgeprägt ist, als wir bisher angenommen hatten. Daher ist ein neuer Ansatz zum Nachweis der BAT-Aktivität und ihrer Beteiligung an Stoffwechselstörungen erforderlich⁷. Ein Versuch, dieses Problem zu lösen, besteht darin, das BVT-Volumen mit Magnetresonanztomographie (MRT) bei Prädiabetikern und Patienten mit Diabetes mellitus Typ 2 (T2DM) mit Insulinresistenz zu messen¹¹. Das mittels MRT gemessene BVT-Volumen ist jedoch kein ausreichender Indikator für die Abschätzung der täglichen Funktion und Verwendung von Glukose und Fettsäuren mittels BAT. Um reale Unterschiede in der BAT-Aktivität bei gesunden und T2DM-Patienten abschätzen zu können, ist daher ein neuer Ansatz erforderlich, der die Möglichkeit bietet, den pathologischen Mechanismus der BAT-Fehlfunktion bei T2DM-Patienten herauszufinden.

Um die Aktivierung von BVT zu bestimmen, führten wir Messungen der BAT-Wärmeproduktion vor und nach einer Mahlzeit mittels Infrarot (IR)-Thermografie durch (Abbildung 1)^12,13. Die Etablierung der IR-Thermografie als Methode der Wahl zur Messung der BAT-Aktivität nach einer Mahlzeit bei gesunden und adipösen Personen oder Patienten mit Diabetes mellitus wird einen großen Einfluss auf das Feld haben. Bis heute wird die IR-Thermografie zur Bestimmung der kälteinduzierten Aktivierung von BVT^13,14,15 eingesetzt. In der jüngeren Menschheitsgeschichte ist die kälteinduzierte BAT-Aktivität nicht mehr sehr ausgeprägt (aufgrund der richtigen Beheizung der Lebensräume, der richtigen Kleidung), während die BAT-Aktivierung nach einer Mahlzeit jeden Tag erfolgt. Darüber hinaus ist die physiologische Regulation dieser beiden BAT-Funktionen über den Hypothalamus völlig unterschiedlich. Nach einer Mahlzeit führt die Aktivierung von Proopiomelanocortin (POMC)-exprimierenden Neuronen im Nucleus arcuatus hypothalamicuatus (Arc) zu einer Erhöhung der Aktivität des Sympathikus über rRPa¹⁶. Die kälteinduzierte Aktivierung von BAT, gemessen durch IR-Thermografie oder PET-CT, ist ungeeignet, wenn sie als Maß für die tägliche BAT-Aktivität verwendet wird. Auf eine erhöhte BAT-Aktivität nach einer Mahlzeit folgt eine Glukoseverwertung, die letztendlich für die Aufrechterhaltung der Glukosehomöostase, der Insulinsensitivität und der täglichen Regulierung der Glukosekonzentration wichtig ist. Die postprandiale BAT-Aktivierung führt zu einem Anstieg des postprandialen Glukoseverbrauchs, gefolgt von einer Erhöhung der Wärmeproduktion und der Körpertemperatur (DIT). Es zeigte sich, dass dies abhängig von Geschlecht, Alter und BMI^{ist 12}. Ähnliche geschlechtsspezifische Unterschiede bei der BAT-Aktivierung nach einer Mahlzeit wurden bei männlichen und weiblichen Labormäusen beobachtet¹⁷. Diese Ergebnisse korrespondieren mit kürzlich entdeckten geschlechtsspezifischen Unterschieden in der Regulation von BAT von Burke et al., die zeigten, dass sich die hypothalamische Regulation der BAT-Bräunung über eine Subpopulation von POMC-Neuronen in männlichen und weiblichen Mäusen unterscheidet¹⁸. Die postprandiale Aktivierung von BAT ist bei Frauen, älteren Bevölkerungsgruppen und adipösen Menschen geringer. Die fehlende BAT-Aktivierung nach einer Mahlzeit (verminderte Glukoseverwertung) könnte zu einer höheren Prävalenz einer gestörten Glukosetoleranz bei Frauen führen 19,20,21,22. Leider wurden die meisten Studien zur BAT-Aktivierung nur an Männern durchgeführt. Durch die Aktivierung von BAT nach einer Mahlzeit erhöht sich die Glukoseaufnahme in der mageren männlichen Bevölkerung. Es ist nicht verwunderlich, dass nach BAT-Aktivierung die DIT bei BVT-positiven männlichen Probanden höher ist ^8,9. Darüber hinaus verbessert die BAT-Transplantation bei männlichen Mäusen die Glukosetoleranz, erhöht die Insulinsensitivität und verringert das Körpergewicht und die Fettmasse²³.

Die PET-CT versagt als Methode der Wahl zur Messung der BVT-Aktivität, insbesondere nach einer Mahlzeit. Daher wurde eine nicht-invasive und sensitivere Methode entwickelt. Die IR-Thermografie ermöglicht die Abschätzung der BAT-Aktivität bei verschiedenen Versuchstieren (Knock-out-Mäusen) sowie bei menschlichen Teilnehmern, unabhängig von Geschlecht, Alter oder den Auswirkungen verschiedener pathologischer Zustände auf die BAT-Aktivität. Ein weiterer Vorteil dieser Methode ist die Einfachheit für Teilnehmer und Versuchstiere, die es uns ermöglicht, den potenziellen Nutzen einer BAT-Booster-Therapie abzuschätzen. Die neueren Studien, in denen die IR-Thermografie zur Bestimmung des physiologischen Verhaltens von BVT nach Kälteeinwirkung oder einer Mahlzeit eingesetzt wurde, werden in der aktuellen Veröffentlichung von Brasil et ^al.24 beschrieben.

Protocol

Alle Versuchsverfahren an Versuchstieren wurden von der Nationalen Ethikkommission und dem Landwirtschaftsministerium genehmigt (EP 185/2018). Die Versuche wurden in Übereinstimmung mit dem Ethikkodex der Kroatischen Gesellschaft für Versuchstierkunde und den ARRIVE-Richtlinien durchgeführt. Alle Verfahren, die in Studien mit menschlichen Teilnehmern durchgeführt wurden, entsprachen der Deklaration von Helsinki und wurden von der Ethikkommission der Medizinischen Fakultät der Universität Zagreb (UP/I-322-01/18-01/5…

Representative Results

Der einfachste Weg, die BVT-Aktivität zu bestimmen, besteht darin, die maximale Hauttemperatur vor und nach einer Mahlzeit bei menschlichen Probanden über die BVT zu subtrahieren. Eine bessere Methode zur Berechnung der BAT-Aktivität besteht darin, zwei Bereiche von Interesse auszuwählen: den Hautbereich oberhalb des BAT, der sich im supraklavikulären Bereich befindet, und den interklavikulären Bereich der Haut, in dem beim Menschen kein BAT-Gewebe gefunden wird, der als Referenzbereich ausgewiesen ist (nach PET-CT…

Discussion

Neuere Studien liefern zunehmend Hinweise auf die physiologische Regulation und Bedeutung der BAT-Aktivität bei erwachsenen Menschen und Tieren bei der Entwicklung von Adipositas und Diabetes mellitus. Darüber hinaus wird eine mögliche BAT-Aktivierung durch exogene Aktivatoren zum Ziel von Pharmaunternehmen. Um die physiologische Regulation und pathophysiologische Bedeutung von BVT bei sehr belastenden Erkrankungen abschätzen zu können und einen möglichen Therapieansatz zu entdecken, wird die Infrarot-Thermografie …

Materials

0.1% cresyl violet acetate	Commonly used chemical
Device for measuring air temperature and humidity	Kesterl	Kestrel 4200	Certificat of conformity
External data storage	Hard Drive with at least 1 TB
Glass microscopic slides	Commonly used
Small cotton tip swab	Urethral swabs
Software for analysis	FLIR Systems, Wilsonville, OR, USA	FLIR Tools
Software for meassurements	FLIR Systems, Wilsonville, OR, USA	ResearchIR software	FLIR ResearchIR Max, version 4.40.12.38 (64-bit)
Thermac Camera	FLIR Systems, Wilsonville, OR, USA	FLIR T-1020