Summary
Burada, insanlarda ve laboratuvar hayvanlarında bir yemekten sonra kahverengi yağ dokusu aktivitesini ölçmek için bir protokol sunuyoruz.
Abstract
Bir yemekten sonra veya obez veya diyabetik hastalarda pozitron emisyon tomografisi bilgisayarlı tomografi (PET-BT) ile kahverengi yağ dokusu (BAT) aktivitesinin ölçülmesi, bir yemekten sonra 18F-florodeoksiglukoz (FDG) birikimi ile tercih edilen yöntem olarak başarısız olmaktadır. Bunun temel nedeni, 18F-FDG'nin, BAT hücrelerinin zarındaki aynı glikoz taşıyıcısı için postprandiyal yüksek glikoz plazma konsantrasyonu ile rekabet etmesidir. Ek olarak, BAT, PET-BT ile görünmeyen ve obez ve diyabetik hastalarda glikoz konsantrasyonu ile birlikte değiştirilebilen bir enerji kaynağı olarak yağ asitlerini de kullanır. Bu nedenle BAT'ın hayvanlarda ve insanlarda fizyolojik önemini tahmin etmek için son yayınlarda kullanılan yeni bir kızılötesi termografi yöntemi uygulanmaktadır.
Gece oruç tuttuktan sonra, BAT aktivitesi, insan gönüllüleri ve dişi vahşi tip farelerde yemekten önce ve sonra kızılötesi termografi ile ölçüldü. Kamera yazılımı, nesneden uzaklığı, cilt yayılımı, yansıyan oda sıcaklığını, hava sıcaklığını ve bağıl nemi kullanarak nesnenin sıcaklığını hesaplar. Farelerde, BAT'ın üzerindeki traş edilmiş alan, ortalama ve maksimum sıcaklıkların ölçüldüğü ilgi çekici bir bölgeydi. Dişi farelerde östrus döngüsünün fazı, kresil menekşe (% 0.1) leke çözeltisi ile boyanmış vajinal yaymalarla yapılan bir deneyden sonra belirlendi. Sağlıklı gönüllülerde, boynun iki cilt bölgesi seçildi: supraklaviküler alan (BAT hücrelerinin bulunduğu köprücük kemiğinin üstünde) ve interklaviküler alan (BAT dokusunun tespit edilmediği köprücük kemikleri arasında). BAT etkinliği, bu iki değerin çıkarılmasıyla belirlenir. Ayrıca, cilt bölgelerinin ortalama ve maksimum sıcaklıkları hayvanlarda ve insan katılımcılarında belirlenebilir.
İnvaziv olmayan ve daha hassas bir yöntem olan kızılötesi termografi ile ölçülen bir yemekten sonra BAT aktivitesindeki değişikliklerin, laboratuvar hayvanlarında östrus döngüsünün cinsiyeti, yaşı ve fazına bağlı olduğu gösterilmiştir. Diyete bağlı termogenezin bir parçası olarak, insanlarda BAT aktivasyonunun cinsiyet, yaş ve vücut kitle indeksine bağlı olduğu kanıtlanmıştır. Bir yemekten sonra BAT aktivitesindeki patofizyolojik değişikliklerin daha fazla belirlenmesi, yüksek glukoz plazma konsantrasyonlarına (obezite ve diabetes mellitus tip 2) sahip katılımcılar ve farklı laboratuvar hayvanlarında (nakavt fareleri) büyük önem taşıyacaktır. Bu yöntem aynı zamanda BAT aktivitesini gençleştirebilecek olası aktive edici ilaçları belirlemek için değişken bir araçtır.
Introduction
Kahverengi yağ dokusu (BAT), beyaz yağ dokusunun (WAT) aksine, enerji depolamaz, aksine enerji harcar. Sempatik stimülasyon üzerine, BAT yağ asitleri ve glikoz kullanır ve ayrışan protein 1'in (UCP1) aktivasyonu ile ısı üretir. UCP1'in işlevi, ATP yerine ısı üretmek için iki mitokondriyal membran arasında bir H + gradyanı kullanmaktır. BAT'ın işlevi, soğuk koşullar altında ısı üretimini arttırmaktır, bu da enerji harcamasında bir artışa yol açar1. Soğuğa maruz kaldıktan sonra, deriden gelen duyusal girdiler, hipotalamik preoptik alanın (POA) medyan preoptik (MnPO) çekirdeğindeki sıcaklığa duyarlı nöronları inhibe eder ve bu da POA nöronlarının rostral raphe pallidus (rRPa) üzerindeki inhibitör etkisini azaltır. rRPa nöronlarının aktivasyonu sempatik aktiviteyi arttırır, bunu BAT aktivitesinde bir artış izler 2,3. Soğuğa bağlı BAT aktivasyonu insanlarda insülin duyarlılığını artırır4 ve bu aktivite vücut kitle indeksi (VKİ) artmış veyaşı 1,5,6,7 olan insanlarda azalır.
Soğuğa bağlı termojenezdeki rolünün yanı sıra, bir yemekten sonra, BAT'taki glikoz alımı yağsız erkek popülasyonunda artar ve BAT pozitif erkek deneklerde daha yüksek olan diyete bağlı termojeneze (DIT) katkıda bulunur 8,9. BAT aktivitesini ölçmek için kullanılan en son teknoloji, PET-BT olarak bilinen pozitron emisyon tomografisi bilgisayarlı tomografidir. Bu yöntem, radyotracer florodeoksiglukoz birikimini (18F-FDG) ölçerek BAT aktivitesini belirler. Bununla birlikte, PET-BT, bir yemekten sonra BAT'ın aktivasyonunu tespit etmek için tercih edilen yöntem olarak başarısız olur. Bunun nedenlerinden biri, bir yemekten sonra, 18F-FDG'nin aynı glikoz taşıyıcısı için postprandiyal hiperglisemi ile rekabet etmesidir, bu da özellikle sağlıklı ve diyabetik katılımcılardaki BAT aktivitesini kan şekeri konsantrasyonlarındaki olası farklılıklarla karşılaştırırken, bir yemekten sonra BAT aktivasyonunu belirlemek için uygun değildir. Ayrıca, BAT, PET-CT ile görünmeyen ısı üretimi için yağ asitlerini bir enerji kaynağı olarak kullanır. 18 Bir yemekten sonra BAT'ta F-FDG birikimi zar zor görülebilir10 ve bu nedenle çoğu durumda olumsuz bir sonuç olarak yorumlanır. Şaşırtıcı olmayan bir şekilde, son zamanlarda, BAT'ın aktivasyonunun insan popülasyonunda daha önce düşündüğümüzden daha belirgin olduğu öne sürüldü; Bu nedenle, BAT aktivitesini ve metabolik bozukluklara katılımını saptamak için yeni bir yaklaşım gereklidir7. Bu sorunu çözmeye yönelik bir girişim, prediyabetik hastalarda ve insülin direnci olan diabetes mellitus tip 2 (T2DM) hastalarında manyetik rezonans görüntüleme (MRG) ile BAT hacmini ölçmektir11. Bununla birlikte, MRG ile ölçülen BAT hacmi, BAT tarafından glikoz ve yağ asitlerinin günlük fonksiyonunu ve kullanımını tahmin etmek için yeterli bir gösterge değildir. Bu nedenle, sağlıklı ve T2DM hastalarında BAT aktivitesindeki gerçek farklılıkları tahmin etmek için, T2DM hastalarında BAT fonksiyon bozukluğunun patolojik mekanizmasını bulma imkanı sunan yeni bir yaklaşıma ihtiyaç vardır.
BAT'nin aktivasyonunu belirlemek için, kızılötesi (IR) termografi kullanarak yemekten önce ve sonra BAT ısı üretiminin ölçümlerini gerçekleştirdik (Şekil 1)12,13. IR termografisinin, sağlıklı ve obez bireylerde veya diabetes mellituslu hastalarda yemekten sonra BAT aktivitesini ölçmek için tercih edilen bir yöntem olarak oluşturulması, alan üzerinde büyük bir etkiye sahip olacaktır. Bu güne kadar, IR termografisi, BAT13,14,15'in soğuğa bağlı aktivasyonunun belirlenmesi için kullanılmaktadır. Yakın insanlık tarihinde, soğuğa bağlı BAT aktivitesi artık çok belirgin değildir (habitatların uygun şekilde ısıtılması, uygun kıyafetler nedeniyle), bir yemekten sonra BAT aktivasyonu her gün gerçekleşir. Ayrıca, bu iki BAT fonksiyonunun hipotalamus yoluyla fizyolojik düzenlenmesi tamamen farklıdır. Bir yemekten sonra, hipotalamik kavisli çekirdekte (Arc) proopiomelanokortin (POMC) eksprese eden nöronların aktivasyonu, rRPa16 yoluyla sempatik sinir aktivitesinde bir artışa yol açar. IR termografisi veya PET-BT ile ölçülen BAT'ın soğuğa bağlı aktivasyonu, günlük BAT aktivitesi için bir ölçü olarak kullanıldığında uygun değildir. Bir yemekten sonra artan BAT aktivitesini, glikoz homeostazını, insülin duyarlılığını ve glikoz konsantrasyonunun günlük düzenlenmesini korumak için sonuçta önemli olan glikoz kullanımı izler. Postprandiyal BAT aktivasyonu, postprandiyal glikoz tüketiminde bir artışa, ardından ısı üretiminde ve vücut ısısında (DIT) bir artışa yol açar. Bunun cinsiyet, yaş ve VKİ'ye bağlı12 olduğu gösterilmiştir. Bir yemekten sonra BAT aktivasyonunda benzer cinsiyet farklılıkları erkek ve dişi laboratuvar farelerinde gözlenir17. Bu bulgular, POMC nöronlarının bir alt popülasyonu yoluyla BAT kahverengileşmesinin hipotalamik düzenlemesinin erkek ve dişi farelerde farklılık gösterdiğini gösteren Burke ve ark. tarafından BAT'ın düzenlenmesinde yakın zamanda keşfedilen cinsiyet farklılıklarına karşılık gelmektedir18. BAT'ın postprandiyal aktivasyonu kadınlarda, yaşlı popülasyonlarda ve obez kişilerde daha küçüktür. Bir yemekten sonra BAT aktivasyonunun olmaması (glikoz kullanımının azalması), kadınlardabozulmuş glikoz toleransı prevalansının daha yüksek olmasına neden olabilir 19,20,21,22. Ne yazık ki, BAT aktivasyonu ile ilgili çalışmaların çoğu sadece erkekler üzerinde yapılmıştır. Bir yemekten sonra BAT'ı aktive ederek, yağsız erkek popülasyonunda glikoz alımı artar. BAT aktivasyonundan sonra, DIT'in BAT pozitif erkek deneklerde daha yüksek olması şaşırtıcı değildir 8,9. Ayrıca, erkek farelerde BAT transplantasyonu glikoz toleransını arttırır, insülin duyarlılığını arttırır ve vücut ağırlığını ve yağ kütlesini azaltır23.
PET-BT, özellikle bir yemekten sonra, BAT aktivitesini ölçmek için tercih edilen bir yöntem olarak başarısız olur. Bu nedenle non-invaziv ve daha hassas bir yöntem geliştirilmiştir. IR termografisi, cinsiyet, yaş veya farklı patolojik koşulların BAT aktivitesi üzerindeki etkilerinden bağımsız olarak, farklı laboratuvar hayvanlarında (nakavt fareler) ve insan katılımcılarında BAT aktivitesinin tahmin edilmesini sağlar. Bu yöntemin ek bir yararı, katılımcılar ve laboratuvar hayvanları için basitliktir ve bu da BAT güçlendirici tedavisinin potansiyel faydalarını tahmin etmemizi sağlar. Soğuğa maruz kaldıktan veya bir yemekten sonra BAT'ın fizyolojik davranışını belirlemek için IR termografisini kullanan son çalışmalar, Brasil ve ark.24'ün son yayınında açıklanmıştır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Laboratuvar hayvanları üzerinde yapılan tüm deneysel prosedürler Ulusal Etik Kurul ve Tarım Bakanlığı tarafından onaylanmıştır (EP 185/2018). Deneyler, Hırvatistan Laboratuvar Hayvanları Bilimi Derneği'nin Etik Kodeksi ve ARRIVE yönergelerine uygun olarak gerçekleştirildi. İnsan katılımcıları içeren çalışmalarda gerçekleştirilen tüm prosedürler Helsinki Deklarasyonu'na uygun olarak yapılmış ve Zagreb Üniversitesi Tıp Fakültesi Etik Komitesi tarafından onaylanmıştır (UP/I-322-01/18-01/56). Bu çalışmada üç kadın katılımcının (VKİ: 29 kg/m2 ± 5 kg/m2) elde edilen sonuçları sunuyoruz. Tüm insan gönüllülerden çalışmaya katılımları ve verilerin sunulması için bilgilendirilmiş onam alınmıştır.
1. İnsanlarda bir yemekten sonra kahverengi yağ dokusunun aktivasyonunun ölçülmesi
NOT: Bazal BAT aktivitesini mümkün olduğunca düşük tutmak için deneyleri günlük sıcaklığın 22 ° C'nin altında olmadığı yaz aylarında gerçekleştirin.
- Kontrol sağlıklı katılımcılarını dikkatlice seçin (eğer BAT aktivitesi patolojik koşullar altında tahmin edilecekse), çünkü BAT aktivitesi cinsiyet, yaş, VKİ ve hatta östrus döngüsünün fazına bağımlıdır.
- Kadın katılımcıların adet döngüsünün evresini tahmin etmek için, onlara ortalama adet döngüsünün ne kadar sürdüğü ve son adetlerinin ilk gününün tarihi hakkında sorular sorun. Deneylerin tarihini işaretlemeyi unutmayın.
NOT: Sağlıklı kontroller ve patolojik koşulları olan katılımcılar mümkün olduğunca benzer olmalı ve sadece araştırılan hastalıkta farklılık göstermelidir.
- Kadın katılımcıların adet döngüsünün evresini tahmin etmek için, onlara ortalama adet döngüsünün ne kadar sürdüğü ve son adetlerinin ilk gününün tarihi hakkında sorular sorun. Deneylerin tarihini işaretlemeyi unutmayın.
- Katılımcılardan iyi dinlenmelerini, kahvaltı yapmamalarını (oruç tutmamaları-kalori almamalarını), deneyler için sabah saatlerinde toplanmalarını ve sempatik aktivasyon yoluyla kas aktivitesi sırasında olası BAT aktivasyonunu önlemek için en az 30 dakika dinlenmelerini isteyin.
- Temel BAT aktivitesini belirlerken cilt yüzeyinin ısınmasının olası etkilerinden (giysilerin termal etkileri) kaçınmak için katılımcılardan ölçümlerden 15 dakika önce üst giysilerini çıkarmalarını isteyin. Uygun oda sıcaklığında (22-27 °C) ölçümler yapın.
- Kızılötesi ölçümler yapın.
- Katılımcılar dinlenirken, termal kamerayı (dedektör tipi: soğutulmamış mikrobolometre; dedektör aralığı: 17 μm; kamera spektral aralığı: 7,5-14,0 μm; termal hassasiyet: 30 °C'de 20 mK; lensler: 36 mm; çözünürlük: 1024 piksel x 768 piksel; anlık görüş alanı [IFOV]: 0,47 mRad) tripodun üzerine monte edin ve katılımcının oturacağı yerden 1 m uzağa yerleştirin.
NOT: Ölçümler soğuk havalarda (dış hava sıcaklıkları %50 nemde 15 °C'nin altında) yapılıyorsa, ölçümleri yapmadan önce fotoğraf makinesini oda sıcaklığına getirin ve en az 1 saat boyunca açın. Soğuk aletler, otomatik kalibrasyon nedeniyle oda sıcaklığına kadar ısındıktan sonra farklı sonuçlar verebilir. - Termal kamerayı üretici tarafından talimat verildiği şekilde bir bilgisayara ve yazılıma bağlayın. Ölçülen sıcaklık olarak sunulan odanın yansıyan sıcaklığını belirlemek için alüminyum folyoyu (buruşuk sonra gerilmiş alüminyum folyo) 1 m'lik bir odak mesafesinde kaydedin. Kamera yazılımında, 0 m mesafeyi ve 1 emisyonluluğu girin.
NOT: Yansıyan görünür sıcaklık, kameranın emissivitesi 1.0 ve mesafe 0 m olarak ayarlandığında ve ölçümler buruşuk ve gerilmiş alüminyum folyo üzerinde alındığında elde edilen bir parametredir. Yansıyan görünür sıcaklık, dedektör üzerindeki ortamdan gelen toplam olay kızılötesi radyasyonunun bir yaklaşımını temsil eder. - Ölçümlere başlamadan hemen önce, oda hava sıcaklığını ve hava nemini belirleyin (daha sonraki analizler için gereklidir). Tek bir termal görüntü çekmek yerine, bir film kaydedin. Filmden, daha sonra değerli verileri kaybetme olasılığını azaltmak için analiz için mümkün olan en iyi görüntü çerçevesini seçin.
- Kayda başlamadan önce, aşağıdaki parametreleri ayarlayın: 10-15 s'de (veya istenen başka bir değerde) video kaydının süresi, 5 fps'de kare hızı (saniyedeki kare sayısı) veya başka bir değer (elimizde 5 fps gereken maksimum değerdir) ve aşağıda açıklandığı gibi diskte filmin kaydedileceği bir konum.
- Ana kamera penceresinin üstündeki yazılımda, soldan üçüncü simgeyi seçin. Açılır menüde, Kayıt Ayarlarını Düzenle'yi seçin, ardından yeni bir pencere açılır.
- Kayıt modunda, Diske Kaydet'i seçin ve bunun altında, Bu Süre için Kayıt'ı istediğiniz zaman ayarlayın. Aynı pencerenin kayıt seçeneklerinde, kayıt hızını 5 (Hz) ile sınırlayın ve kayıtların kaydedileceği konumu seçin.
- Kare hızını ayarlamak için mevcut pencereyi kapatın, ana menüde Düzenle'yi açın ve Tercihler'i seçin. Açılan pencerenin sağ tarafında, Hedef Kare Hızı'na 5 girin. Aşağıdaki aynı pencerede, Kısayol Tuşu/Uzaktan Başlatma Kaydı Durdurabilir öğesini seçin ve açılır menüden Başlat/Durdur modunda'yı seçin.
NOT: Bellek tükettiği için mümkün olan en düşük kare hızıyla mümkün olan en kısa filmleri yapmaya çalışın. Bu ayarlarda, bir kayıtta yaklaşık 100 Mb olacaktır.
- Katılımcılar dinlenirken, termal kamerayı (dedektör tipi: soğutulmamış mikrobolometre; dedektör aralığı: 17 μm; kamera spektral aralığı: 7,5-14,0 μm; termal hassasiyet: 30 °C'de 20 mK; lensler: 36 mm; çözünürlük: 1024 piksel x 768 piksel; anlık görüş alanı [IFOV]: 0,47 mRad) tripodun üzerine monte edin ve katılımcının oturacağı yerden 1 m uzağa yerleştirin.
- Katılımcıyı, boynun supraklaviküler bölgesi, BAT'ın bulunduğu köprücük kemiğinin üzerinde (Şekil 1) 1 m odak mesafesinde olacak şekilde konumlandırın ve F5 tuşuna basarak 5 fps kare hızında kısa bir film (10-15 sn) kaydedin. Kayıt belirlenen zamanda duracaktır.
- Ölçümler sırasında odada sadece katılımcının ve ölçümleri yapan kişinin bulunduğundan emin olun. Hava hareketinden veya cereyandan kaçının (örneğin, klimadan). Katılımcıların soğuk taslaktan, güneş ışığından (doğrudan veya dolaylı) veya ampuller gibi herhangi bir ısı kaynağından uzak durduğundan emin olun.
- Uygunsa, kılcal kandaki kan şekeri konsantrasyonlarını parmak ucundan standart bir glukometre ile ve bir aksiller termometre kullanarak vücut sıcaklığını ölçün.
- Tüm katılımcıların aynı yemeği yediğinden emin olun. Test edilen deneklerin gıda kısıtlamalarına ve gereksinimlerine dikkat edin (örneğin, diyabetik hastalar için yemek). Kontrol (sağlıklı) insanlar ve metabolik bozukluğu olan katılımcılar da dahil olmak üzere tüm katılımcılar aynı yemeği yemelidir.
NOT: Diyabetik hastaların tüketebileceği yemekler hakkında daha fazla bilgi için, yerel bir endokrinologla iletişime geçin veya diabetes mellitustan muzdarip katılımcılarla görüşün. - Yemekten sonra istediğiniz saatte, aynı ayar değerlerini kullanarak F5 tuşuna basarak yeni kaydı yapın. Kayıtlar için ayarlanan protokolü tekrarlamayın. Ölçümleri yemekten 30 dakika, 1 saat, 2 saat ve 3 saat sonra tekrarlayın12. Özel çalışma tasarımınız için, yemekten sonraki süre daha kısa veya daha uzun olabilir, ancak en azından ilk üç zaman noktasını öneririz.
NOT: Ölçümler hızlı yapılsa bile, katılımcı sayısının sınırlandırılması dört ila altıdır. Daha fazla sayıda katılımcıyla, bazıları için gecikme süresi çok uzun olacaktır.
2. Laboratuvar hayvanlarında yemekten sonra kahverengi yağ dokusunun aktivasyonunun ölçülmesi
NOT: Hayvanlar, düzenlenmiş oda sıcaklığına ve 12 saat / 12 saatlik bir gündüz / gece döngüsüne sahip bir hayvan tesisinde barındırıldığından, deneyler herhangi bir mevsimde gerçekleştirilebilir. Deneyler sırasında oda sıcaklığı 22 °C ile 27 °C arasında olmalıdır. Bu çalışmada, diestrustaki altı dişi hayvan ve altı erkek vahşi tip (WT) C57Bl / 6NCrl hayvan incelendi.
- Hayvanları kurumun etik kurallarına göre uyuşturun. Bu çalışmada anestezi, i.p. ketamin/ksilazin enjeksiyonları kullanılarak (sırasıyla 80-100 mg/kg ve 6-8 mg/kg) yapıldı. Anestezi sırasında korneanın kurumasını önlemek için her iki göze de göz jeli uygulayın. Test hayvanlarının interskapular bölgelerini deneylerden bir gün önce (cildin omuz bıçakları arasındaki bölgesi) küçük bir hayvan düzeltici kullanarak tıraş edin.
- Deneylerden bir gün önce, dişi hayvanlarda östrus döngüsünün aşamasını da belirler.
NOT: Östrus döngüsünün fazı vajinal yaymalarla belirlenir.- Bir pamuklu uç çubuğunu oda sıcaklığında steril tuzlu su çözeltisine (% 0.9 NaCl) batırın ve vajinaya yerleştirin. Vajinal duvarı çubukla hafifçe kazıyın, ekli hücreleri bir cam slayt üzerine yayın ve havanın kurumasını bekleyin.
- Hayvanları kafeslerine geri koyun. Hücreleri 500 μL% 0.1 kresil menekşe asetat ile 1 dakika boyunca lekeleyin, daha sonra 3 kez suyla durulayın.
- Hücreleri 100x büyütme ve parlak alan aydınlatması ile ışık mikroskobu altında görüntüleyin. Smear25'te gözlenen lökositlerin ve çekirdekli ve kornifiye epitel hücrelerinin sayısına dayanarak östrus döngüsünün fazını belirleyin.
- Deneylerden önceki akşam hayvanların yiyeceklerini su ad libitum ile çıkarın (gece boyunca oruç tutun). En iyi yol, kafeslerdeki olası yiyecek kalıntılarını önlemek için hayvanları yeni temiz kafeslere aktarmaktır.
- Deney gününün sabahında, insan katılımcıları test etmek için yapıldığı gibi termal kamera ve kayıt ayarlarını hazırlayın.
- IR ölçümleri yapmadan önce hayvanları rahatsız etmeyin veya strese neden olmayın. Hayvanı dikkatlice temiz bir kafese yerleştirin (diğer hayvanların kokusunun hayvanın sempatik sistemi üzerinde hiçbir etkisi olmadığından emin olun). Kafesi termal kameranın altına 1 m odak uzaklığına yerleştirin. F5 tuşuna basarak bir film kaydedin.
- Her hayvana vermeden önce yiyecek peletini tartın, böylece yiyecek alımı hesaplanabilir. Hayvanın kafesinde 30 dakika yemesine izin verin ve yemekten sonra yiyecek peletini tekrar tartın. Bu çalışmada, dişi hayvanlar 0.038 ± 0.004 g gıda / vücut ağırlığı yediler.
NOT: Kan şekeri konsantrasyonlarını ölçmeye karar verirseniz, bunun sempatik sistem tarafından BAT aktivasyonuna yol açmayacağından emin olmak için ölçümleri yemekten önce ancak IR ölçümlerinden sonra yapın. - IR ölçümlerini yemeğe başladıktan sonra istediğiniz saatte tekrarlayın (genellikle yemekten 30 dakika, 1 saat ve 2 saat sonra)17,26.
- Tüm deneyler tamamlandıktan sonra, yukarıda açıklandığı gibi dişi hayvanlarda östrus döngüsünün fazını tekrar test edin (dişi hayvanlar, östrus döngüsünün istenen aşamasından beklenenden daha erken çıkabilir).
3. Termal kayıtların analizi
NOT: Termal kamera yazılımı, nesnenin sıcaklığını beş değişken kullanarak hesaplar.
- Analizden önce yazılımda aşağıdaki değişkenleri ayarlayın: cilt yayılımı, e = 0,9815,27, yansıtılan oda sıcaklığı (alüminyum folyo görüntüsünden hesaplandığı gibi), hava sıcaklığı, bağıl nem, nesneye uzaklık = 1 m. Bu değerlere sahip yazılımı kullanarak analizi gerçekleştirin.
NOT: Tercih edilen renk paleti gökkuşağıdır, çünkü köprücük kemiğinin üzerindeki BAT'ın daha kolay algılanmasını sağlayan daha fazla ton kullanır. - Her film için, listelenen değişkenleri ana pencerenin sağ tarafındaki kamera yazılımına girin. Oynatma kafasını ekranın alt kısmına hareket ettirerek veya Duraklat düğmesine basarak filmden uygun kareyi (görüntü) seçin.
- Ana pencerenin sol tarafındaki alanın istediğiniz şeklini seçerek ilgilendiğiniz bölgeyi (ROI) seçin. Köprücük kemiklerinin üstündeki veya arasındaki cilt alanına en uygun şekli seçin.
- YG seçildiğinde, YG'nin minimum, maksimum ve ortalama sıcaklıkları sağ tarafta görüntülenir. Görüntüde, kırmızı üçgen kaydedilen maksimum sıcaklık noktasını temsil eder ve mavi üçgen kaydedilen minimum sıcaklığı temsil eder. Kaydın birkaç saniyesi boyunca ölçülen sıcaklığın sabit olduğundan emin olmak için bu adımı birkaç kare boyunca tekrarlayın.
- Laboratuvar hayvanlarında postprandiyal BAT aktivitesindeki artışı belirlemek için bir yemekten önce cilt bölgesinin BAT'ın üzerindeki maksimum sıcaklıklarını yemekten sonraki maksimum sıcaklıklardan çıkarın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
BAT aktivitesini belirlemenin en kolay yolu, insan deneklerde yemekten önce ve sonra BAT'ın üzerindeki maksimum cilt sıcaklığını çıkarmaktır. BAT aktivitesini hesaplamanın daha iyi bir yolu, iki ilgi alanı seçmektir: supraklaviküler alanda bulunan BAT'nin üzerindeki cilt alanı ve insanlarda BAT dokusunun bulunmadığı, referans alanı olarak belirlenen cildin interklaviküler alanı (PET-BT'ye göre; Şekil 1). BAT aktivitesi daha sonra bu iki sıcaklığın çıkarılmasıyla kolayca belirlenir. Şekil 1'de görüldüğü gibi BAT aktivitesi 1.8 °C olarak belirlenmiştir. Beslenmeden sonra BAT'ın aktivasyonunu belirlemek için, bu bir yemekten sonra belirlenen zaman noktalarında tekrarlandı12. Bu çalışmada üç kadın katılımcı ile deneyler yaptık. VKİ'leri sırasıyla 23 kg/m2 ve 34 kg/m2 olan katılımcı 1 ve katılımcı 2'den de benzer sonuçlar elde edilmiştir. Katılımcı 3, en düşük VKİ'ye (18 kg /m2) ve bir yemekten sonra BAT aktivitesinde en yüksek artışa sahipti (Şekil 1B, solda). Cildin supraklaviküler bölgesindeki maksimum sıcaklık, BAT aktivitesinin iyi bir temsili değildir, çünkü yemekten 3 saat sonra bile cilt sıcaklığında bir düşüş yoktur (Şekil 1B, sağda). İnsan popülasyonu arasındaki BAT aktivitesindeki farklılıklar nedeniyle, sonuçların analizi bireysel olarak yapılmalı ve / veya çalışma için katılımcı seçimi çok dikkatli yapılmalıdır. Laboratuvar hayvanlarında BAT aktivitesinde böyle bir fark yoktur, çünkü yakından ilişkilidirler.
Bu yöntemin PET-CT (18F-FDG) kullanımına kıyasla ilk avantajı, ısı kaynağından bağımsız olarak BAT aktivitesini ölçmesidir. Bu nedenle, IR termografisi çok daha hassastır ve farklı fizyolojik veya patofizyolojik koşullar altında BAT aktivitesini daha doğru bir şekilde temsil eder. Bu yöntem, yaş, cinsiyet veya östrus döngüsünün evresi gibi BAT aktivitesinde değişikliklere yol açan fizyolojik koşulları belirlemek için kullanılabilir. İnsanlarda, ek bir fayda, obezite ve diabetes mellitus tip 2 gibi metabolik hastalıklarda BAT aktivitesindeki patofizyolojik değişiklikleri belirleme yeteneğidir. Yüksek kan şekeri konsantrasyonuna sahip kişilerin BAT aktivitesini sağlıklı kontrollerle karşılaştırırken özel bir fayda görülebilir, çünkü PET-BT'de radyoaktif glikoz, vücuttaki glikoz ile aynı glikoz taşıyıcılarıyla rekabet eder ve bu da yanlış negatif sonuçlara veya BAT aktivitesinin yanlış beyanlarına yol açar.
Olası bir endişe, cildin kalınlığındaki farklılıklardır, özellikle deri altı beyaz yağ dokusu, farklı deneklerde cilt sıcaklığını BAT'ın üzerinde değiştirebilir28. Bu sorun, yemekten önce ve sonra BAT aktivasyonunu karşılaştırarak önlenebilir. Genellikle, farklı patofizyolojik durumlar için aktivite ve takip edilen önem, soğuğa maruz kaldıktan sonra BAT aktivasyonu ile belirlenir. Bununla birlikte, bu tür BAT aktivasyonu mevsimseldir ve insanlarda (vahşi doğadaki hayvanlarla karşılaştırıldığında) çok önemli değildir. BAT aktivitesinin günlük yaşam üzerindeki etkilerini ve glukoz homeostazını belirlemek için, bir yemekten sonra BAT aktivasyonu ve ardından glikoz ve yağ asidi kullanımı uygun yoldur.
Sıcak ortamlarda veya kas aktivitesinden çok kısa bir süre sonra yapılan ölçümlere dikkat edilmelidir. Kas aktivitesi vücut ısısını arttırır, bu da ciltte vazodilatasyona yol açar (Şekil 2). BAT'ın üzerinde, çevredeki cilt bölgelerine kıyasla görünür daha sıcak bir cilt alanı olmadığında, kayıtları çalışmadan hariç tutun.
Laboratuvar hayvanlarında BAT aktivitesi, skapula (interskapular BAT, iBAT) arasında bulunan BAT'ın maksimum sıcaklığı ile cildin iBAT'ın üzerindeki ortalama sıcaklığı ile belirlenir. Laboratuvar hayvanlarında cildin ortalama sıcaklığını BAT'ın üzerinde ölçmek daha kolaydır, çünkü insanlardan daha lokalizedir (Şekil 3). Bu çalışmada, bir yemekten sonra BAT aktivitesindeki değişiklikler, diestrustaki dişi WT hayvanlarında (28.2 ± 0.5 haftalık) ölçülmüştür. Şekil 3'te gösterildiği gibi, BAT aktivitesindeki istatistiksel olarak anlamlı değişiklikler, yemekten 30 dakika sonra, ancak yalnızca maksimum sıcaklık ölçüldüğünde belirlenmiştir (p < 0.05). BAT aktivitesi ortalama sıcaklıklardaki değişiklikler olarak sunulduğunda, değişim anlamlı değildi (p = 0.066). Bu nedenle, BAT aktivitesini interskapuler cilt bölgesinin maksimum sıcaklığındaki değişikliklerle sunmak, sonuçları sunmanın daha iyi bir yoludur. BAT aktivitesindeki bu değişiklik, yutulan gıda miktarı ile pozitif korelasyon gösterdi (r = 0.65).
Her iki denek grubu için de başlıca endişeler, erkek ve dişi ve genç ve yaşlı hayvanlarda BAT aktivasyonundaki biyolojik farklılıkların yanı sıra östrus döngüsü17 sırasında BAT aktivitesindeki farklılıklardır. Son yemekten geçen süreye özel dikkat gösterilmelidir, bu da yukarıdaki protokole uyulmaması durumunda tahmin edilmesi zor olacaktır. Sabahları aynı saatte deneyler yapmak yeterince kesin değildir17.
BAT aktivitesini ölçerken ek bir endişe, hayvanlarda stresi mümkün olduğunca önlemektir. Herhangi bir rahatsızlık sempatik aktiviteyi ve dolayısıyla BAT aktivitesini artıracaktır16. Ayrıca, sıcaklık kayıtlarını içeren hataların çoğu, farelerin interskapular bölgesi düzgün bir şekilde tıraş edilmezse ortaya çıkabilir ve bu da cildin yanlış bölgesinin ölçülmesine neden olabilir.
Resim 1: Kızılötesi termografi. (A) İki cilt alanı seçilir: biri kahverengi yağ dokusunun üstünde (BAT; supraklaviküler alan) ve ikincisi interklaviküler alanda (bu alan-referans noktasının derisinin altında BAT dokusu bulunmaz). BAT yeri, köprücük kemiğinin üzerindeki en sıcak alan olarak sunulmaktadır. PET-BT'ye göre boyundaki BAT lokalizasyonunun şematik gösterimi sol şekilde sunulmuştur. Sıcaklıklar, etrafı sarılmış cilt bölgelerinde ölçülen maksimum sıcaklıklardır. Bar 5 cm'yi temsil eder. (B) Her iki cilt bölgesindeki maksimum sıcaklıklar arasındaki farklar, her katılımcı için sunulur ve bir yemekten 2 saat sonra BAT aktivitesindeki artışı gösterir (solda). BAT aktivitesi, BAT'ın üzerindeki cildin maksimum sıcaklıkları ile sunulamaz (sağda). Sonuçlar, ortalamanın ortalama ± standart hatası olarak sunulur. * p < başlangıç değerine kıyasla 0,05 (eşleştirilmiş ANOVA). Kısaltma: SC = supraskapular. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: BAT aktivitesinin ölçülemediği durumlar. Şekil, cilt kan damarlarının artan vazodilatasyonu nedeniyle BAT aktivitesini belirlemenin mümkün olmadığı koşulları temsil etmektedir. Çubuk 5 cm'yi temsil eder. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Laboratuvar farelerinde kahverengi yağ dokusu. (A,B) İnterskapuler kahverengi yağ dokusu (BAT) soğuğa maruz kaldıktan sonra aktive olur ve ancak daha sonra PET-BT ile 18F-FDG birikimi olarak gösterilir. BAT'ın aktivitesi soğuğa maruz kalmadan bir termal kamera ile görülebilir. (C) BAT'ın termal taramadaki konumu, PET-CT görüntüsünde bir okla sunulan BAT'a karşılık gelir. Tıraş edilen alan, sıcaklıktaki tüm değişiklikleri görebilmek için BAT'tan daha büyüktür (Tmax'ın yeri mükemmel bir şekilde tahmin edilememiştir ve bazı çalışmalarda ortalama sıcaklık ölçülebilir). Çubuk 1 cm'yi temsil eder. (D) Dietrustaki altı dişi fare için BAT'ın üzerindeki cildin ölçülen maksimum ve ortalama sıcaklıkları sunulmuştur. Sonuçlar, ortalamanın ortalama ± standart hatası olarak sunulur. * p < başlangıç değerine kıyasla 0,05 (eşleştirilmiş ANOVA). Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Son zamanlarda yapılan çalışmalar, obezite ve diabetes mellitus gelişiminde yetişkin insan ve hayvanlarda BAT aktivitesinin fizyolojik regülasyonu ve önemi ile ilgili artan kanıtlar sunmaktadır. Ayrıca, eksojen aktivatörler tarafından olası BAT aktivasyonu, ilaç şirketleri için bir hedef haline gelmektedir. Çok külfetli hastalıklarda BAT'ın fizyolojik regülasyonunu ve patofizyolojik önemini tahmin edebilmek ve potansiyel bir terapötik yaklaşım keşfetmek için kızılötesi termografi tercih edilen yöntem haline gelmektedir. IR teknolojisi, BAT aktivitesini ölçmede yeni bir tercih yöntemi olarak ortaya çıksa da, 12,13,14,15,17, uygulanan yöntemin kendisine değil, BAT aktivasyonunun fizyolojik özelliklerine özel dikkat gösterilmelidir. İnsan katılımcılarda ve laboratuvar hayvanlarında cinsiyete, yaşa, östrus döngüsünün evresine, beslenme durumuna ve olası strese özellikle dikkat edilmelidir.
İnsanlar ve laboratuvar hayvanları üzerinde yapılan bir yemekten sonra BAT aktivitesinin artmasına ilişkin ölçümler oldukça benzerdir12,17. Bu ölçümlerin yapılmasında kritik adımlar stres ve kas aktivitesinden kaçınmayı içerir (ölçümler yapılmadan önce hayvanlar rahatsız edilmemelidir). Kadın katılımcılar için, östrus (menstrüel) siklus sırasında BAT aktivitesindeki fonksiyonel farklılıklar dikkate alınmalıdır. Ayrıca, cilt çıplak olmalıdır (gereksiz stresi önlemek için deneyler yapılmadan bir gün önce hayvanlar tıraş edilmelidir). Ayrıca, mümkün olan en iyi termal çözünürlüğü elde etmek için kamera yazılımını doğru şekilde ayarlamak çok önemlidir. Verileri termal görüntüler olarak sunmak için en iyi yol, belirli bir çalışmaya uygun bir renklendirme paleti seçmektir. Protokol düzgün bir şekilde takip edilirse, IR termografisinin yapılmasında hata yapma olasılığı daha düşüktür.
Yöntemin sınırlaması, hafif bir endişe duymadan, farklı miktarlarda deri altı yağına (veya obez hayvanlara normal vücut ağırlığına sahip hayvanlara) sahip insanlar arasındaki BAT aktivitesini karşılaştırmanın mümkün olmamasıdır. Bu sorunu önlemek için, yemekten önce ve sonra BAT aktivitesini ölçerek kontrol ile aynı konu kullanılmalıdır. Bir yemekten sonra BAT aktivitesindeki artışın hesaplanması, deri altı BAT'tan cilt yüzeyine ısı dağılımındaki farklılıkları ortadan kaldıracaktır.
Her iki cilt bölgesinin maksimum cilt sıcaklıkları arasındaki değişiklikler yoluyla BAT aktivitesini raporlamak, bizim açımızdan daha iyi bir yoldur, çünkü ortalama sıcaklık ölçümleriyle elde edilen sonuçlarda BAT boyutundaki ve / veya belirlenmiş cilt alanındaki farklılıkları ortadan kaldırır29.
Daha önce de belirtildiği gibi, bugüne kadar BAT aktivitesini ölçmek için tercih edilen yöntem, radyoaktif glikoz (18F-FDG) kullanarak PET-BT'dir. Bu yöntemin zamanla yeterince hassas olmadığı kanıtlanmıştır, radyoaktif madde kullanımı ile ilgilidir ve çok pahalıdır. PET-BT, bir yemekten sonra BAT aktivasyonunu belirlemede işe yaramaz. 18 Bir yemekten sonra BAT'ta F-FDG birikimi zar zor görülebilir10 ve olumsuz bir sonuç olarak kabul edilir. Son zamanlarda, BAT aktivasyonunun insan popülasyonunda daha belirgin olduğu ve bu nedenle metabolik hastalıkların gelişiminde ve yayılmasında giderek daha önemli olduğu öne sürülmüştür7. Bu sorunu çözmeye yönelik bir girişim, prediyabetik ve insülin direnci olan T2DM'li hastalarda BAT hacmini MRG ile ölçmektir11. Ancak BAT miktarı, BAT'ın aktivitesi ve diyabetik hastalarda önemli olan glikoz ve yağ asitlerinin kullanımı hakkında herhangi bir bilgi vermemektedir.
IR termografisinin, özellikle yüksek kan şekeri konsantrasyonuna sahip insan deneklerde, BAT aktivitesini ölçmek için tercih edilen bir yöntem olarak kurulması, alan üzerinde büyük bir etkiye sahip olacaktır. IR termografisi, sağlıklı gönüllülerde 12 velaboratuvar hayvanlarında 17 BAT 13,14,15'in soğuğa bağlı aktivasyonunun ve son zamanlarda bir yemekten sonra BAT aktivasyonunun belirlenmesinde kullanılır. Postprandiyal BAT aktivasyonu, türler ne olursa olsun kadınlarda ve yaşlı deneklerde daha küçüktür. Ne yazık ki, BAT aktivasyonu ve metabolik çalışmalar üzerine yapılan araştırmaların çoğu sadece erkek denekler (erkek laboratuvar hayvanları veya erkekler) üzerinde gerçekleştirilmiştir. Bu yaklaşımdaki sorun, östrus döngüsünün fazının BAT aktivitesi30 üzerindeki etkisini göz ardı etmesidir.
Son olarak, IR termografisi, farklı insan popülasyonlarında, özellikle menopoz öncesi ve sonrası kadınlarda, çalışmaları eksik olan BAT'ın fizyolojik ve patofizyolojik önemini araştırma olasılığını sağlayacaktır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yok.
Acknowledgments
Bu çalışma Hırvat Bilim Vakfı araştırma hibesi (IP-2018-01- 7416) tarafından finanse edilmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.1% cresyl violet acetate | Commonly used chemical | ||
| Device for measuring air temperature and humidity | Kesterl | Kestrel 4200 | Certificat of conformity |
| External data storage | Hard Drive with at least 1 TB | ||
| Glass microscopic slides | Commonly used | ||
| Small cotton tip swab | Urethral swabs | ||
| Software for analysis | FLIR Systems, Wilsonville, OR, USA | FLIR Tools | |
| Software for meassurements | FLIR Systems, Wilsonville, OR, USA | ResearchIR software | FLIR ResearchIR Max, version 4.40.12.38 (64-bit) |
| Thermac Camera | FLIR Systems, Wilsonville, OR, USA | FLIR T-1020 |
References
- van Marken Lichtenbelt, W. D., et al. Cold-activated brown adipose tissue in healthy men. New England Journal of Medicine. 360 (15), 1500-1508 (2009).
- Morrison, S. F., Nakamura, K. Central neural pathways for thermoregulation. Frontiers in Bioscience. 16 (1), 74-104 (2011).
- Contreras, C., et al.
- Chondronikola, M., et al. Brown adipose tissue improves whole-body glucose homeostasis and insulin sensitivity in humans. Diabetes. 63 (12), 4089-4099 (2014).
- Ouellet, V., et al. Outdoor temperature, age, sex, body mass index, and diabetic status determine the prevalence, mass, and glucose-uptake activity of 18F-FDG-detected BAT in humans. Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism. 96 (1), 192-199 (2011).
- Pfannenberg, C., et al. Impact of age on the relationships of brown adipose tissue with sex and adiposity in humans. Diabetes. 59 (7), 1789-1793 (2010).
- Leitner, B. P., et al. Mapping of human brown adipose tissue in lean and obese young men. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (32), 8649-8654 (2017).
- Vosselman, M. J., et al. Brown adipose tissue activity after a high-calorie meal in humans. American Journal of Clinical Nutrition. 98 (1), 57-64 (2013).
- Hibi, M., et al. Brown adipose tissue is involved in diet-induced thermogenesis and whole-body fat utilization in healthy humans. International Journal of Obesity. 40 (11), 1655-1661 (2016).
- Fenzl, A., Kiefer, F. W. Brown adipose tissue and thermogenesis. Hormone Molecular Biology and Clinical Investigation. 19 (1), 25-37 (2014).
- Koksharova, E., et al. The relationship between brown adipose tissue content in supraclavicular fat depots and insulin sensitivity in patients with type 2 diabetes mellitus and prediabetes. Diabetes Technology & Therapeutics. 19 (2), 96-102 (2017).
- Habek, N., Kordić, M., Jurenec, F., Dugandžić, A. Infrared thermography, a new method for detection brown adipose tissue activity after a meal in humans. Infrared Physics & Technology. 89, 271-276 (2018).
- Lee, P., Ho, K. K. Y. Hot fat in a cool man: Infrared thermography and brown adipose tissue. Diabetes, Obesity and Metabolism. 13 (1), 92-93 (2011).
- Ang, Q. Y., et al. A new method of infrared thermography for quantification of brown adipose tissue activation in healthy adults (TACTICAL): A randomized trial. Journal of Physiological Sciences. 67 (3), 395-406 (2017).
- Jang, C., et al. Infrared thermography in the detection of brown adipose tissue in humans. Physiological Reports. 2 (11), 12167 (2014).
- Dodd, G. T., et al. Leptin and insulin act on POMC neurons to promote the browning of white fat. Cell. 160 (1-2), 88-104 (2015).
- Habek, N., et al. Activation of brown adipose tissue in diet-induced thermogenesis is GC-C dependent. Pflügers Archiv: European Journal of Physiology. 472 (3), 405-417 (2020).
- Burke, L. K., et al. Sex difference in physical activity, energy expenditure and obesity driven by a subpopulation of hypothalamic POMC neurons. Molecular Metabolism. 5 (3), 245-252 (2016).
- Glumer, C., Jorgensen, T., Borch-Johnsen, K. Prevalences of diabetes and impaired glucose regulation in a Danish population: The Inter99 study. Diabetes Care. 26 (8), 2335-2340 (2003).
- Sicree, R. A., et al. Differences in height explain gender differences in the response to the oral glucose tolerance test-the AusDiab study. Diabetic Medicine. 25 (3), 296-302 (2008).
- van Genugten, R. E., et al. Effects of sex and hormone replacement therapy use on the prevalence of isolated impaired fasting glucose and isolated impaired glucose tolerance in subjects with a family history of type 2 diabetes. Diabetes. 55 (12), 3529-3535 (2006).
- Williams, J. W., et al. Gender differences in the prevalence of impaired fasting glycaemia and impaired glucose tolerance in Mauritius. Does sex matter. Diabetic Medicine. 20 (11), 915-920 (2003).
- Stanford, K. I., et al. Brown adipose tissue regulates glucose homeostasis and insulin sensitivity. Journal of Clinical Investigation. 123 (1), 215-223 (2013).
- Brasil, S., et al. A systematic review on the role of infrared thermography in the brown adipose tissue assessment. Reviews in Endocrine and Metabolic Disorders. 21 (1), 37-44 (2020).
- Byers, S. L., Wiles, M. V., Dunn, S. L., Taft, R. A. Mouse estrous cycle identification tool and images. PLoS One. 7 (4), 35538 (2012).
- Crane, J. D., Mottillo, E. P., Farncombe, T. H., Morrison, K. M., Steinberg, G. R. A standardized infrared imaging technique that specifically detects UCP1-mediated thermogenesis in vivo. Molecular Metabolism. 3 (4), 490-494 (2014).
- Hartwig, V., et al. Multimodal imaging for the detection of brown adipose tissue activation in women: A pilot study using NIRS and infrared thermography. Journal of Healthcare Engineering. 2017, 5986452 (2017).
- James, L., et al. The use of infrared thermography in the measurement and characterization of brown adipose tissue activation. Temperature. 5 (2), 147-161 (2018).
- Folgueira, C., et al. Hypothalamic dopamine signaling regulates brown fat thermogenesis. Nature Metabolism. 1 (8), 811-829 (2019).
- Ratko, M., Habek, N., Kordić, M., Dugandžić, A. The use of infrared technology as a novel approach for studies with female laboratory animals. Croatian Medical Journal. 61 (4), 346-353 (2020).
