Summary
Här presenterar vi ett protokoll för mätning av brun fettvävnadsaktivitet efter en måltid hos människor och försöksdjur.
Abstract
Mätning av brun fettvävnadsaktivitet (BAT) genom positronemissionstomografi datortomografi (PET-CT) via ackumulering av 18F-fluorodeoxiglukos (FDG) efter en måltid eller hos överviktiga eller diabetiska patienter misslyckas som valmetod. Huvudorsaken är att 18F-FDG konkurrerar med den postprandiella höga glukosplasmakoncentrationen om samma glukostransportör på BAT-cellernas membran. Dessutom använder BAT fettsyror som energikälla, vilket inte syns med PET-CT och kan ändras tillsammans med glukoskoncentrationen hos överviktiga och diabetiska patienter. För att uppskatta den fysiologiska betydelsen av BAT hos djur och människor används därför en ny infraröd termografimetod som används i senare publikationer.
Efter fasta över natten mättes BAT-aktiviteten med infraröd termografi före och efter en måltid hos frivilliga försökspersoner och honmöss av vildtyp. Kameraprogramvaran beräknar objektets temperatur med hjälp av avstånd från objektet, hudens emissivitet, reflekterad rumstemperatur, lufttemperatur och relativ luftfuktighet. Hos möss var det rakade området ovanför BAT ett intressant område för vilket genomsnittliga och maximala temperaturer mättes. Fasen av estrouscykeln hos kvinnliga möss bestämdes efter ett experiment med vaginala utstryk färgade med kresylviolett (0,1%) fläcklösning. Hos friska frivilliga valdes två hudområden i nacken: det supraklavikulära området (ovanför nyckelbenet, där BAT-celler finns) och det interklavikulära området (mellan nyckelbenen, där ingen BAT-vävnad detekteras). BAT-aktiviteten bestäms av subtraktionen av dessa två värden. Dessutom kan de genomsnittliga och maximala temperaturerna i hudområden bestämmas hos djur och mänskliga deltagare.
Förändringar i BAT-aktivitet efter en måltid mätt med infraröd termografi, en icke-invasiv och känsligare metod, visade sig vara beroende av kön, ålder och fas i brunstcykeln hos försöksdjur. Som en del av kostinducerad termogenes har BAT-aktivering hos människor också visat sig vara beroende av kön, ålder och kroppsmassindex. Ytterligare bestämning av patofysiologiska förändringar i BAT-aktivitet efter en måltid kommer att vara av stor betydelse för deltagare med höga plasmakoncentrationer av glukos (fetma och diabetes mellitus typ 2), liksom hos olika försöksdjur (knock-out-möss). Denna metod är också ett variabelt verktyg för att bestämma möjliga aktiverande läkemedel som kan föryngra BAT-aktiviteten.
Introduction
Brun fettvävnad (BAT), i motsats till vit fettvävnad (WAT), lagrar inte utan spenderar snarare energi. Vid sympatisk stimulering använder BAT fettsyror och glukos och producerar värme genom aktivering av frikopplingsprotein 1 (UCP1). UCP1: s funktion är att använda en H + gradient mellan två mitokondriella membran för att producera värme istället för ATP. BAT:s funktion är att öka värmeproduktionen under kalla förhållanden, vilket leder till en ökning av energiförbrukningen1. Efter kall exponering hämmar sensoriska ingångar från huden värmekänsliga neuroner i median preoptisk (MnPO) kärna i det hypotalamiska preoptiska området (POA), vilket minskar den hämmande effekten av POA-neuroner på rostral raphe pallidus (rRPa). Aktiveringen av rRPa-neuroner ökar den sympatiska aktiviteten, vilket följs av en ökning av BAT-aktiviteten 2,3. Kallinducerad BAT-aktivering förbättrar insulinkänsligheten hos människa4, och denna aktivitet minskar hos människor med ökat kroppsmasseindex (BMI) och ålder 1,5,6,7.
Bortsett från dess roll i kallinducerad termogenes, efter en måltid, ökar glukosupptaget i BAT i den magra manliga befolkningen, vilket bidrar till dietinducerad termogenes (DIT), vilket är högre hos BAT-positiva manliga försökspersoner 8,9. Den senaste tekniken som används för att mäta BAT-aktivitet är datortomografi med positronemissionstomografi, känd som PET-CT. Denna metod bestämmer BAT-aktiviteten genom att mäta ackumuleringen av radiotracern fluorodeoxiglukos (18F-FDG). PET-CT fungerar dock inte som val av metod för att detektera aktivering av BAT efter en måltid. En av anledningarna är att 18F-FDG efter en måltid konkurrerar med postprandial hyperglykemi om samma glukostransportör, vilket gör den olämplig för att bestämma BAT-aktivering efter en måltid, särskilt vid jämförelse av BAT-aktivitet hos friska och diabetiska deltagare med möjliga skillnader i blodsockerkoncentrationer. BAT använder dessutom fettsyror som energikälla för värmeproduktion, vilket inte syns med PET-CT. 18 F-FDG-ackumulering i BAT efter en måltid är knappt synlig10 och tolkas därför som ett negativt resultat i de flesta fall. Föga förvånande föreslogs det nyligen att aktiveringen av BAT är mer uttalad i den mänskliga populationen än vi tidigare trott. Därför är det nödvändigt med en ny metod för att upptäcka BAT-aktivitet och dess inblandning i metaboliska störningar7. Ett försök att lösa detta problem är att mäta volymen BAT med magnetisk resonanstomografi (MRT) hos prediabetiker och patienter med diabetes mellitus typ 2 (T2DM) med insulinresistens11. BAT-volymen mätt med MRT är dock inte en tillräcklig indikator för att uppskatta den dagliga funktionen och användningen av glukos och fettsyror med BAT. För att uppskatta verkliga skillnader i BAT-aktivitet hos friska jämfört med T2DM-patienter behövs därför ett nytt tillvägagångssätt som ger möjlighet att ta reda på den patologiska mekanismen för BAT-funktionsfel hos T2DM-patienter.
För att bestämma aktiveringen av BAT utförde vi mätningar av BAT-värmeproduktionen före och efter en måltid med infraröd (IR) termografi (figur 1)12,13. Att etablera IR-termografi som en metod för att mäta BAT-aktivitet efter en måltid hos friska och feta individer eller patienter med diabetes mellitus kommer att ha en enorm inverkan på fältet. Än idag används IR-termografi för bestämning av kallinducerad aktivering av BAT13,14,15. Under senare tid i mänskligheten är den kallinducerade BAT-aktiviteten inte särskilt uttalad längre (på grund av korrekt uppvärmning av livsmiljöer, lämpliga kläder), medan BAT-aktivering efter en måltid sker varje dag. Dessutom är den fysiologiska regleringen av dessa två BAT-funktioner via hypotalamus helt annorlunda. Efter en måltid leder aktiveringen av proopiomelanokortin (POMC)-uttryckande neuroner i den hypotalamiska bågformiga kärnan (Arc) till en ökning av sympatisk nervaktivitet via rRPa16. Kallinducerad aktivering av BAT mätt med IR-termografi eller PET-CT är felaktig när den används som ett mått för daglig BAT-aktivitet. Ökad BAT-aktivitet efter en måltid följs av glukosutnyttjande, vilket i slutändan är viktigt för att upprätthålla glukoshomeostas, insulinkänslighet och den dagliga regleringen av glukoskoncentrationen. Postprandial BAT-aktivering leder till en ökning av postprandial glukosförbrukning, följt av en ökning av värmeproduktion och kroppstemperatur (DIT). Detta visade sig vara kön, ålder och BMI-beroende12. Liknande könsskillnader i BAT-aktivering efter måltid observeras hos han- och honlaboratoriemöss17. Dessa fynd motsvarar nyligen upptäckta könsskillnader i regleringen av BAT av Burke et al., som visade att den hypotalamiska regleringen av BAT browning via en subpopulation av POMC-neuroner skiljer sig åt hos manliga och kvinnliga möss18. Den postprandiella aktiveringen av BAT är mindre hos kvinnor, äldre populationer och feta personer. Avsaknad av BAT-aktivering efter måltid (minskat glukosutnyttjande) kan leda till en högre prevalens av nedsatt glukostolerans hos kvinnor 19,20,21,22. Tyvärr gjordes majoriteten av studierna om BAT-aktivering endast på män. Genom att aktivera BAT efter en måltid ökar glukosupptaget i den magra manliga populationen. Det är inte förvånande att DIT efter BAT-aktivering är högre hos BAT-positiva manliga försökspersoner 8,9. Dessutom förbättrar BAT-transplantation hos hanmöss glukostoleransen, ökar insulinkänsligheten och minskar kroppsvikt och fettmassa23.
PET-CT misslyckas som en valfri metod för att mäta BAT-aktivitet, särskilt efter en måltid. Därför utvecklades en icke-invasiv och känsligare metod. IR-termografi möjliggör uppskattning av BAT-aktivitet hos olika försöksdjur (knock-out-möss) och hos människor, oavsett kön, ålder eller effekterna av olika patologiska tillstånd på BAT-aktiviteten. En ytterligare fördel med denna metod är enkelheten för deltagare och försöksdjur, vilket gör att vi kan uppskatta de potentiella fördelarna med BAT-boosterbehandling. De nyligen genomförda studierna med IR-termografi för att bestämma det fysiologiska beteendet hos BAT efter kall exponering eller en måltid beskrivs i den senaste publikationen av Brasil et al.24.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla försök på försöksdjur har godkänts av den nationella etikkommittén och jordbruksministeriet (EP 185/2018). Experimenten utfördes i enlighet med den etiska kodexen från det kroatiska samhället för försöksdjursvetenskap och ARRIVE-riktlinjerna. Alla procedurer som utfördes i studier med mänskliga deltagare var i enlighet med Helsingforsdeklarationen och godkänd av etikkommittén vid universitetet i Zagreb, School of Medicine (UP/I-322-01/18-01/56). I denna studie presenterar vi resultaten från tre kvinnliga deltagare (BMI: 29 kg/m 2 ± 5 kg/m2). Informerat samtycke erhölls från alla frivilliga försökspersoner för deras deltagande i studien och för presentation av data.
1. Mätning av aktivering av brun fettvävnad efter en måltid hos människor
OBS: Utför experimenten under sommaren när dagstemperaturen inte är lägre än 22 °C för att hålla den basala BAT-aktiviteten så låg som möjligt.
- Välj noggrant friska kontrolldeltagare (om BAT-aktiviteten ska uppskattas under patologiska förhållanden) eftersom BAT-aktiviteten är beroende av kön, ålder, BMI och till och med fasen av brunstcykeln.
- För att uppskatta fasen av menstruationscykeln hos kvinnliga deltagare, fråga dem frågor om hur länge deras genomsnittliga menstruationscykel är och datumet för den första dagen i deras sista menstruation. Glöm inte att markera datumet för experimenten.
OBS: Korrekt urval av matchande kontrollpersoner är den svåraste delen av kliniska studier eftersom friska kontroller och deltagare med patologiska tillstånd bör vara så lika som möjligt och skilja sig endast i den undersökta sjukdomen.
- För att uppskatta fasen av menstruationscykeln hos kvinnliga deltagare, fråga dem frågor om hur länge deras genomsnittliga menstruationscykel är och datumet för den första dagen i deras sista menstruation. Glöm inte att markera datumet för experimenten.
- Be deltagarna att vila bra, att inte äta frukost (fasta - inget intag av kalorier), att samlas på morgontimmarna för experimenten och att vila i minst 30 minuter för att undvika eventuell BAT-aktivering under muskelaktivitet via sympatisk aktivering.
- Be deltagarna att ta av sig överkläderna 15 minuter före mätningarna för att undvika eventuella effekter av uppvärmning av hudytan (termiska effekter av kläder) medan de bestämmer BAT-aktiviteten vid baslinjen. Utför mätningar vid lämplig rumstemperatur (22-27 °C).
- Utför infraröda mätningar.
- Medan deltagarna vilar, montera värmekameran (detektortyp: okyld mikrobolometer; detektorhöjd: 17 μm; kameraspektralområde: 7,5-14,0 μm; termisk känslighet: 20 mK vid 30 °C; linser: 36 mm; upplösning: 1024 pixlar x 768 pixlar; momentant synfält [IFOV]: 0,47 mRad) på stativet och placera det 1 m från den plats där deltagaren kommer att sitta.
OBS: Om mätningarna utförs i kallare väder (utomhuslufttemperaturer under 15 °C vid 50% luftfuktighet), sätt kameran i rumstemperatur och slå på den i minst 1 h innan mätningarna utförs. Kalla instrument kan ge olika resultat efter uppvärmning till rumstemperatur på grund av autokalibrering. - Anslut värmekameran till en dator och programvara enligt tillverkarens anvisningar. Spela in aluminiumfolie (skrynklig och sedan sträckt aluminiumfolie) på ett brännvidd på 1 m för att bestämma rummets reflekterade temperatur, presenterad som uppmätt temperatur. I kameraprogramvaran matar du in avståndet på 0 m och emissiviteten på 1.
OBS: Den reflekterade skenbara temperaturen är en parameter som erhålls när kamerans emissivitet är inställd på 1,0 och avståndet till 0 m och mätningarna görs på skrynklig och sedan sträckt aluminiumfolie. Reflekterad skenbar temperatur representerar en approximation av den totala infraröda strålningen på detektorn från omgivningen. - Strax innan mätningarna påbörjas, bestäm rumstemperaturen och luftfuktigheten (nödvändig för senare analys). Istället för att ta en termisk bild, spela in en film. Från filmen väljer du senare den bästa möjliga bildramen för analys för att minska risken för att förlora värdefull data.
- Innan du startar inspelningen ställer du in följande parametrar: varaktigheten för videoinspelning vid 10-15 s (eller något annat önskat värde), bildhastigheten vid 5 fps (bilder per sekund) eller något annat värde (i våra händer är 5 fps det maximala som behövs) och en plats på disken där filmen kommer att sparas, som beskrivs nedan.
- I programvaran ovanför huvudkamerafönstret väljer du den tredje ikonen från vänster. I popupmenyn väljer du Redigera postinställningar, varefter ett nytt fönster öppnas.
- I inspelningsläge väljer du Spela in på disk, och under det, ställ in posten för denna varaktighet vid önskad tidpunkt. I inspelningsalternativen i samma fönster begränsar du inspelningshastigheten till 5 (Hz) och väljer platsen där inspelningarna ska sparas.
- För att ställa in bildhastigheten, stäng det befintliga fönstret, öppna Redigera i huvudmenyn och välj Inställningar. I den högra delen av det öppnade fönstret anger du 5 i Target Frame Rate. I samma fönster nedan väljer du Snabbtangent / fjärrstart kan stoppa inspelning och i rullgardinsmenyn väljer du I Start / stoppläge.
OBS: Försök att göra kortast möjliga filmer med lägsta möjliga bildhastighet eftersom det är minneskrävande. Vid dessa inställningar kommer en post att ha cirka 100 Mb.
- Medan deltagarna vilar, montera värmekameran (detektortyp: okyld mikrobolometer; detektorhöjd: 17 μm; kameraspektralområde: 7,5-14,0 μm; termisk känslighet: 20 mK vid 30 °C; linser: 36 mm; upplösning: 1024 pixlar x 768 pixlar; momentant synfält [IFOV]: 0,47 mRad) på stativet och placera det 1 m från den plats där deltagaren kommer att sitta.
- Placera deltagaren så att det supraklavikulära området i nacken, ovanför nyckelbenet där BAT är beläget (figur 1), befinner sig på brännvidden på 1 m och spela in en kort film (10–15 s) med en bildhastighet på 5 fps genom att trycka på F5-tangenten . Inspelningen stoppas vid den angivna tiden.
- I rummet vid tidpunkten för mätningarna, se till att endast deltagaren och personen som utför mätningarna är närvarande. Undvik luftrörelser eller drag (t.ex. från luftkonditionering). Se till att deltagarna är borta från kallt drag, solljus (direkt eller indirekt) eller någon värmekälla som glödlampor.
- Om det är lämpligt, mät blodsockerkoncentrationerna i kapillärblod från fingertoppen med en standardglukometer och kroppstemperaturen med en axillär termometer.
- Se till att alla deltagare äter samma måltid. Var uppmärksam på livsmedelsbegränsningarna och kraven hos de testade ämnena (till exempel måltiden för diabetespatienter). Alla deltagare, inklusive kontroll (friska) människor och deltagare med metaboliska störningar, bör äta samma måltid.
OBS: För mer information om måltider som diabetespatienter kan konsumera, kontakta en lokal endokrinolog eller diskutera det med deltagarna som lider av diabetes mellitus. - Vid önskad tidpunkt efter en måltid, gör den nya inspelningen genom att trycka på F5 med samma inställningsvärden. Upprepa inte det inställda protokollet för inspelningar. Upprepa mätningarna vid 30 min, 1 h, 2 h och 3 h efter en måltid12. För din specifika studiedesign kan tiden efter en måltid vara kortare eller längre, men vi rekommenderar åtminstone de tre första tidpunkterna.
OBS: Begränsningen av antalet deltagare är fyra till sex, även om mätningarna görs snabbt. Med ett högre antal deltagare blir fördröjningstiden för vissa för lång.
2. Mätning av aktivering av brun fettvävnad efter måltid hos försöksdjur
OBS: Eftersom djuren hålls i en djuranläggning med reglerad rumstemperatur och en dag / nattcykel på 12 h / 12 h kan försöken utföras under vilken säsong som helst. Rumstemperaturen under försök bör vara mellan 22 °C och 27 °C. I denna studie undersöktes sex hondjur i diestrus och sex manliga vildtypsdjur (WT) C57Bl/6NCrl.
- Bedöva djuren enligt institutionens etiska riktlinjer. I denna studie utfördes anestesi med hjälp av i.p. injektioner av ketamin/xylazin (80-100 mg/kg respektive 6-8 mg/kg). Applicera ögongel på båda ögonen för att förhindra hornhinnetorkning under anestesi. Raka försöksdjurens mellanskulderblad en dag före försöken (hudområdet mellan skulderbladen) med en liten djurtrimmer.
- Dagen före experimenten bestämmer du också fasen av estrouscykeln hos kvinnliga djur.
OBS: Fasen av estrouscykeln bestäms av vaginala utstryk.- Doppa en bomullsspets i rumstemperatur steril saltlösning (0,9% NaCl) och sätt in den i slidan. Skrapa försiktigt vaginalväggen med pinnen, sprid de bifogade cellerna på en glasskiva och låt den lufttorka.
- Sätt tillbaka djuren i sina burar. Färga cellerna med 500 μL 0,1% cresylviolettacetat i 1 minut, skölj dem 3 gånger med vatten.
- Visa cellerna under ett ljusmikroskop med 100x förstoring och ljusfältbelysning. Bestäm fasen av estrouscykeln baserat på antalet leukocyter och kärnförsedda och kornade epitelceller observerade i smet25.
- Ta bort djurens mat kvällen före experimenten (fasta över natten) med vatten ad libitum. Det bästa sättet är att överföra djuren till nya rena burar för att undvika eventuella rester av mat i burarna.
- På morgonen på experimentdagen, förbered värmekameran och inspelningsinställningarna som gjort för att testa de mänskliga deltagarna.
- Stör eller stressa inte djuren innan du utför IR-mätningar. Placera försiktigt djuret i en ren bur (säkerställer att det inte finns några effekter av andra djurs doft på djurets sympatiska system). Placera buret under värmekameran på ett brännvidd på 1 m. Spela in en film genom att trycka på F5.
- Väg matpelleten innan du ger den till varje djur så att matintaget kan beräknas. Låt djuret äta i 30 minuter i buret och väg matpelleten igen efter måltiden. I denna studie åt hondjur 0,038 ± 0,004 g mat/kroppsvikt.
OBS: Om du bestämmer dig för att mäta blodsockerkoncentrationerna, utför mätningarna före en måltid men efter IR-mätningar för att säkerställa att detta inte leder till BAT-aktivering av det sympatiska systemet. - Upprepa IR-mätningar vid önskad tidpunkt efter måltidens början (vanligtvis 30 min, 1 timme och 2 timmar efter måltid)17,26.
- När alla försök har slutförts, testa på nytt fasen i brunstcykeln hos hondjur enligt beskrivningen ovan (hondjur kan lämna den önskade fasen av estrouscykeln tidigare än förväntat).
3. Analysera termiska inspelningar
OBS: Värmekameraprogrammet beräknar objektets temperatur med hjälp av fem variabler.
- Ställ in följande variabler i programvaran före analys: hudemissivitet, e = 0,9815,27, reflekterad rumstemperatur (beräknad från bilden av aluminiumfolie), lufttemperatur, relativ fuktighet, avstånd till objektet = 1 m. Utför analysen med hjälp av programvaran med dessa värden.
OBS: Den föredragna färgpaletten är regnbåge eftersom den använder fler nyanser, vilket möjliggör enklare detektering av BAT ovanför nyckelbenet. - För varje film anger du de listade variablerna i kameraprogramvaran till höger i huvudfönstret. Välj lämplig bildruta (bild) från filmen genom att flytta uppspelningshuvudet längst ner på skärmen eller trycka på pausknappen .
- Välj intresseområde (ROI) genom att välja önskad form på området till vänster i huvudfönstret. Välj den form som bäst motsvarar hudområdet ovanför eller mellan nyckelbenen.
- När ROI väljs visas de minimala, maximala och genomsnittliga temperaturerna för ROI på höger sida. I bilden representerar den röda triangeln punkten för maximal inspelad temperatur och den blå triangeln representerar den minsta registrerade temperaturen. Upprepa detta steg för flera bildrutor för att vara säker på att den uppmätta temperaturen är stabil under några sekunder av inspelningen.
- Subtrahera de maximala temperaturerna i hudområdet ovanför BAT före en måltid från de maximala temperaturerna efter en måltid för att bestämma ökningen av postprandial BAT-aktivitet hos försöksdjur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Det enklaste sättet att fastställa BAT-aktivitet är att subtrahera den maximala hudtemperaturen över BAT före och efter en måltid hos försökspersoner. Ett bättre sätt att beräkna BAT-aktivitet är att välja två intressanta regioner: hudområdet ovanför BAT, som ligger i det supraklavikulära området, och det interklavikulära området i huden där ingen BAT-vävnad finns hos människor, som betecknas som referensområde (enligt PET-CT; Figur 1). BAT-aktiviteten bestäms sedan enkelt genom subtraktion av dessa två temperaturer. Som visas i figur 1 bestämdes BAT-aktiviteten till 1,8 °C. För att bestämma aktiveringen av BAT efter utfodring upprepades detta vid bestämda tidpunkter efter måltid12. I denna studie utförde vi experiment med tre kvinnliga deltagare. Liknande resultat erhölls från deltagare 1 och deltagare 2 med BMI på 23 kg/m 2 respektive 34 kg/m2. Deltagare 3 hade det lägsta BMI (18 kg/m2) och den högsta ökningen av BAT-aktivitet efter en måltid (figur 1B, vänster). Den maximala temperaturen på hudens supraklavikulära område är inte en bra representation av BAT-aktivitet eftersom hudtemperaturen inte minskar ens 3 timmar efter en måltid (figur 1B till höger). På grund av skillnader i BAT-aktivitet bland den mänskliga populationen bör analysen av resultaten göras individuellt och/eller valet av deltagare för studien bör göras mycket noggrant. Det finns ingen sådan skillnad i BAT-aktivitet hos försöksdjur eftersom de är nära besläktade.
Den första fördelen med denna metod jämfört med användningen av PET-CT (18F-FDG) är att den mäter BAT-aktiviteten oberoende av värmekällan. Av den anledningen är IR-termografi mycket känsligare och representerar mer sanningsenligt BAT-aktiviteten under olika fysiologiska eller patofysiologiska förhållanden. Denna metod kan användas för att bestämma de fysiologiska tillstånd som leder till förändringar i BAT-aktiviteten, såsom ålder, kön eller fas i brunstcykeln. Hos människa är en ytterligare fördel förmågan att bestämma de patofysiologiska förändringarna i BAT-aktivitet vid metabola sjukdomar som fetma och diabetes mellitus typ 2. En särskild fördel kunde ses när man jämförde BAT-aktiviteten hos personer med hög blodsockerkoncentration med friska kontroller, eftersom det radioaktiva glukoset vid PET-CT konkurrerar med samma glukostransportörer som glukos i kroppen, vilket leder till falskt negativa resultat eller felaktiga framställningar av BAT-aktivitet.
Ett möjligt problem är skillnaderna i hudens tjocklek, särskilt den subkutana vita fettvävnaden, som kan förändra hudtemperaturen över BAT hos olika försökspersoner28. Detta problem kan undvikas genom att jämföra BAT-aktiveringen före och efter en måltid. Vanligtvis bestäms aktiviteten och den efterföljande betydelsen för olika patofysiologiska tillstånd genom BAT-aktivering efter kall exponering. Denna typ av BAT-aktivering är dock säsongsbetonad och inte särskilt viktig hos människor (jämfört med djur i vildmarken). För att fastställa effekterna av BAT-aktivitet på vardagslivet, liksom glukoshomeostas, är BAT-aktivering efter en måltid följt av glukos- och fettsyrautnyttjande det rätta sättet.
Uppmärksamhet bör ägnas åt de mätningar som utförs i varma omgivningar eller för snart efter muskelaktivitet. Muskelaktivitet ökar kroppstemperaturen, vilket leder till vasodilatation i huden (figur 2). Om det inte finns något synligt varmare hudområde ovanför BAT jämfört med omgivande hudområden, uteslut registreringarna från studien.
BAT-aktiviteten hos försöksdjur bestäms av den maximala temperaturen på BAT mellan skulderbladet (interscapular BAT, iBAT) och hudens medeltemperatur över iBAT. Det är lättare att mäta medeltemperaturen på huden över BAT hos försöksdjur eftersom den är mer lokaliserad än hos människa (figur 3). I denna studie mättes förändringarna i BAT-aktivitet efter en måltid hos kvinnliga WT-djur hos diestrus (28,2 ± 0,5 veckor gamla). Som visas i figur 3 bestämdes statistiskt signifikanta förändringar i BAT-aktivitet 30 minuter efter en måltid, men endast när den maximala temperaturen mättes (p < 0,05). När BAT-aktiviteten presenterades som förändringar i medeltemperaturer var förändringen inte signifikant (p = 0,066). Att presentera BAT-aktiviteten via förändringar i den maximala temperaturen i det interscapulära hudområdet är därför ett bättre sätt att presentera resultaten. Denna förändring i BAT-aktivitet var positivt korrelerad med mängden intagen mat (r = 0,65).
De största problemen för båda försökspersonerna är de biologiska skillnaderna i BAT-aktivering hos hanar och honor och unga och gamla djur, liksom skillnaderna i BAT-aktivitet under brunstcykeln17. Särskild uppmärksamhet bör ägnas åt hur lång tid som gått från den sista måltiden, vilket kommer att vara svårt att uppskatta om ovanstående protokoll inte följs. Att utföra experiment samtidigt på morgonen är inte tillräckligt exakt17.
Ett ytterligare problem vid mätning av BAT-aktivitet är att undvika stress hos djuren så mycket som möjligt. Varje störning ökar den sympatiska aktiviteten och därmed BAT-aktiviteten16. Dessutom kan de flesta misstag som involverar temperaturregistreringar uppstå om mössens interscapulära område inte rakas ordentligt, vilket kan leda till att man mäter fel område på huden.
Figur 1: Infraröd termografi. a) Två hudområden ska väljas: ett ovanför den bruna fettvävnaden (BAT; supraklavikulärt område) och det andra i det interklavikulära området (ingen BAT-vävnad finns under huden i denna referenspunkt). BAT-platsen presenteras som det varmaste området ovanför nyckelbenet. Den schematiska representationen av BAT-platsen i nacken enligt PET-CT presenteras i den vänstra figuren. Temperaturer är maximala temperaturer som mäts i omringade hudområden. Stången representerar 5 cm. (B) Skillnaderna mellan maximala temperaturer i båda hudområdena presenteras för varje deltagare, vilket visar ökningen av BAT-aktiviteten 2 timmar efter en måltid (vänster). BAT-aktivitet kan inte presenteras som maximala temperaturer i huden över BAT (höger). Resultaten presenteras som medelvärde ± medelfel av medelvärdet. * p < 0,05 jämfört med startvärdet (parad ANOVA). Förkortning: SC = suprascapular. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Förhållandena när BAT-aktivitet inte kan mätas. Figuren representerar de tillstånd då det inte är möjligt att fastställa BAT-aktivitet på grund av ökad vasodilatation av hudens blodkärl. Stången representerar 5 cm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Brun fettvävnad hos laboratoriemöss. (A,B) Interscapular brun fettvävnad (BAT) aktiveras efter kall exponering och visas först då som 18F-FDG-ackumulering genom PET-CT. BAT:s aktivitet kunde ses med en värmekamera utan kall exponering. (C) BAT:s placering i den termiska skanningen motsvarar den BAT som presenteras i PET-CT-bilden med en pil. Det rakade området är större än BAT för att kunna se alla temperaturförändringar (platsen för Tmax kunde inte förutsägas perfekt, och i vissa studier kan medeltemperaturen mätas). Stången representerar 1 cm. (D) De uppmätta maximala och genomsnittliga temperaturerna för huden över BAT för sex honmöss i diestrus presenteras. Resultaten presenteras som medelvärde ± medelfel av medelvärdet. * p < 0,05 jämfört med startvärdet (parat ANOVA). Klicka här för att se en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Nya studier presenterar växande bevis för den fysiologiska regleringen och betydelsen av BAT-aktivitet hos vuxna människor och djur vid utveckling av fetma och diabetes mellitus. Dessutom håller möjlig BAT-aktivering av exogena aktivatorer på att bli ett mål för läkemedelsföretag. För att kunna uppskatta den fysiologiska regleringen och patofysiologiska betydelsen av BAT vid mycket betungande sjukdomar, samt upptäcka ett potentiellt terapeutiskt tillvägagångssätt, blir infraröd termografi den metod som valts. Även om IR-tekniken håller på att bli en ny metod för mätning av BAT-aktivitet 12,13,14,15,17, bör särskild uppmärksamhet ägnas inte åt själva den tillämpade metoden utan åt de fysiologiska egenskaperna hos BAT-aktivering. Man bör ägna särskild uppmärksamhet åt kön, ålder, fas av estrouscykeln, utfodringsstatus och eventuell stress hos människor och försöksdjur.
Mätningar av ökningen av BAT-aktivitet efter en måltid utförd på människor och försöksdjur är ganska lika12,17. Kritiska steg vid genomförandet av dessa mätningar inkluderar undvikande av stress och muskelaktivitet (djur bör inte störas innan mätningar utförs). För kvinnliga deltagare bör hänsyn tas till de funktionella skillnaderna i BAT-aktivitet under estrous (menstruations)cykeln. Dessutom bör huden vara bar (djur ska rakas dagen innan experiment utförs för att undvika onödig stress). Dessutom är det mycket viktigt att ställa in kameraprogramvaran korrekt för att få bästa möjliga termiska upplösning. För att presentera data som termiska bilder är det bästa sättet att välja en lämplig färgpalett som passar den specifika studien. Om protokollet följs korrekt finns det mindre möjlighet att göra fel vid IR-termografi.
Metodens begränsning är att det inte är möjligt att utan ringa oro jämföra BAT-aktiviteten mellan personer med olika mängder underhudsfett (eller feta djur med djur med normal kroppsvikt). För att undvika detta problem bör samma ämne användas som kontrollämne genom att mäta BAT-aktiviteten före och efter en måltid. Beräkningen av ökningen av BAT-aktiviteten efter en måltid eliminerar skillnaderna i värmefördelning från subkutan BAT till hudytan.
Att rapportera BAT-aktivitet genom förändringar mellan de maximala hudtemperaturerna för båda hudområdena är enligt vår åsikt ett bättre sätt eftersom det eliminerar skillnaderna i BAT-storlek och/eller angivet hudområde i resultaten från mätningar av medeltemperatur29.
Som tidigare nämnts är den metod som hittills valts för att mäta BAT-aktivitet PET-CT med användning av radioaktivt glukos (18F-FDG). Denna metod har med tiden visat sig inte vara tillräckligt känslig, dess användning av radioaktivt material är oroande och den är mycket dyr. PET-CT är värdelöst vid bestämning av BAT-aktivering efter en måltid. 18 F-FDG-ackumulering i BAT efter en måltid är knappt synlig10 och anses vara ett negativt resultat. Nyligen föreslogs att BAT-aktivering är mer uttalad i den mänskliga befolkningen och därför blir allt viktigare vid utveckling och spridning av metaboliska sjukdomar7. Ett försök att lösa detta problem är att mäta BAT-volymen med MRT hos prediabetiker och patienter med T2DM med insulinresistens11. Mängden BAT ger dock ingen information om BAT-aktiviteten och användningen av glukos och fettsyror, vilket är viktigt hos diabetespatienter.
Att etablera IR-termografi som en metod för att mäta BAT-aktivitet, särskilt hos människor med hög blodsockerkoncentration, kommer att ha en enorm inverkan på fältet. IR-termografi används för bestämning av kallinducerad aktivering av BAT 13,14,15 och, nyligen, BAT-aktivering efter måltid hos friska frivilliga 12 och försöksdjur 17. Den postprandiella BAT-aktiveringen är mindre hos honor och äldre försökspersoner oavsett art. Tyvärr har majoriteten av forskningen om BAT-aktivering och metaboliska studier helt och hållet utförts endast på manliga försökspersoner (manliga laboratoriedjur eller män). Problemet med detta tillvägagångssätt är att det bortser från effekten av estrouscykelns fas på BAT-aktivitet30.
Slutligen kommer IR-termografi att göra det möjligt att undersöka den fysiologiska och patofysiologiska betydelsen av BAT i olika mänskliga populationer, särskilt hos pre- och postmenopausala kvinnor, för vilka studier saknas.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Denna studie finansierades av den kroatiska vetenskapsstiftelsens forskningsbidrag (IP-2018-01-7416).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.1% cresyl violet acetate | Commonly used chemical | ||
| Device for measuring air temperature and humidity | Kesterl | Kestrel 4200 | Certificat of conformity |
| External data storage | Hard Drive with at least 1 TB | ||
| Glass microscopic slides | Commonly used | ||
| Small cotton tip swab | Urethral swabs | ||
| Software for analysis | FLIR Systems, Wilsonville, OR, USA | FLIR Tools | |
| Software for meassurements | FLIR Systems, Wilsonville, OR, USA | ResearchIR software | FLIR ResearchIR Max, version 4.40.12.38 (64-bit) |
| Thermac Camera | FLIR Systems, Wilsonville, OR, USA | FLIR T-1020 |
References
- van Marken Lichtenbelt, W. D., et al. Cold-activated brown adipose tissue in healthy men. New England Journal of Medicine. 360 (15), 1500-1508 (2009).
- Morrison, S. F., Nakamura, K. Central neural pathways for thermoregulation. Frontiers in Bioscience. 16 (1), 74-104 (2011).
- Contreras, C., et al.
- Chondronikola, M., et al. Brown adipose tissue improves whole-body glucose homeostasis and insulin sensitivity in humans. Diabetes. 63 (12), 4089-4099 (2014).
- Ouellet, V., et al. Outdoor temperature, age, sex, body mass index, and diabetic status determine the prevalence, mass, and glucose-uptake activity of 18F-FDG-detected BAT in humans. Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism. 96 (1), 192-199 (2011).
- Pfannenberg, C., et al. Impact of age on the relationships of brown adipose tissue with sex and adiposity in humans. Diabetes. 59 (7), 1789-1793 (2010).
- Leitner, B. P., et al. Mapping of human brown adipose tissue in lean and obese young men. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (32), 8649-8654 (2017).
- Vosselman, M. J., et al. Brown adipose tissue activity after a high-calorie meal in humans. American Journal of Clinical Nutrition. 98 (1), 57-64 (2013).
- Hibi, M., et al. Brown adipose tissue is involved in diet-induced thermogenesis and whole-body fat utilization in healthy humans. International Journal of Obesity. 40 (11), 1655-1661 (2016).
- Fenzl, A., Kiefer, F. W. Brown adipose tissue and thermogenesis. Hormone Molecular Biology and Clinical Investigation. 19 (1), 25-37 (2014).
- Koksharova, E., et al. The relationship between brown adipose tissue content in supraclavicular fat depots and insulin sensitivity in patients with type 2 diabetes mellitus and prediabetes. Diabetes Technology & Therapeutics. 19 (2), 96-102 (2017).
- Habek, N., Kordić, M., Jurenec, F., Dugandžić, A. Infrared thermography, a new method for detection brown adipose tissue activity after a meal in humans. Infrared Physics & Technology. 89, 271-276 (2018).
- Lee, P., Ho, K. K. Y. Hot fat in a cool man: Infrared thermography and brown adipose tissue. Diabetes, Obesity and Metabolism. 13 (1), 92-93 (2011).
- Ang, Q. Y., et al. A new method of infrared thermography for quantification of brown adipose tissue activation in healthy adults (TACTICAL): A randomized trial. Journal of Physiological Sciences. 67 (3), 395-406 (2017).
- Jang, C., et al. Infrared thermography in the detection of brown adipose tissue in humans. Physiological Reports. 2 (11), 12167 (2014).
- Dodd, G. T., et al. Leptin and insulin act on POMC neurons to promote the browning of white fat. Cell. 160 (1-2), 88-104 (2015).
- Habek, N., et al. Activation of brown adipose tissue in diet-induced thermogenesis is GC-C dependent. Pflügers Archiv: European Journal of Physiology. 472 (3), 405-417 (2020).
- Burke, L. K., et al. Sex difference in physical activity, energy expenditure and obesity driven by a subpopulation of hypothalamic POMC neurons. Molecular Metabolism. 5 (3), 245-252 (2016).
- Glumer, C., Jorgensen, T., Borch-Johnsen, K. Prevalences of diabetes and impaired glucose regulation in a Danish population: The Inter99 study. Diabetes Care. 26 (8), 2335-2340 (2003).
- Sicree, R. A., et al. Differences in height explain gender differences in the response to the oral glucose tolerance test-the AusDiab study. Diabetic Medicine. 25 (3), 296-302 (2008).
- van Genugten, R. E., et al. Effects of sex and hormone replacement therapy use on the prevalence of isolated impaired fasting glucose and isolated impaired glucose tolerance in subjects with a family history of type 2 diabetes. Diabetes. 55 (12), 3529-3535 (2006).
- Williams, J. W., et al. Gender differences in the prevalence of impaired fasting glycaemia and impaired glucose tolerance in Mauritius. Does sex matter. Diabetic Medicine. 20 (11), 915-920 (2003).
- Stanford, K. I., et al. Brown adipose tissue regulates glucose homeostasis and insulin sensitivity. Journal of Clinical Investigation. 123 (1), 215-223 (2013).
- Brasil, S., et al. A systematic review on the role of infrared thermography in the brown adipose tissue assessment. Reviews in Endocrine and Metabolic Disorders. 21 (1), 37-44 (2020).
- Byers, S. L., Wiles, M. V., Dunn, S. L., Taft, R. A. Mouse estrous cycle identification tool and images. PLoS One. 7 (4), 35538 (2012).
- Crane, J. D., Mottillo, E. P., Farncombe, T. H., Morrison, K. M., Steinberg, G. R. A standardized infrared imaging technique that specifically detects UCP1-mediated thermogenesis in vivo. Molecular Metabolism. 3 (4), 490-494 (2014).
- Hartwig, V., et al. Multimodal imaging for the detection of brown adipose tissue activation in women: A pilot study using NIRS and infrared thermography. Journal of Healthcare Engineering. 2017, 5986452 (2017).
- James, L., et al. The use of infrared thermography in the measurement and characterization of brown adipose tissue activation. Temperature. 5 (2), 147-161 (2018).
- Folgueira, C., et al. Hypothalamic dopamine signaling regulates brown fat thermogenesis. Nature Metabolism. 1 (8), 811-829 (2019).
- Ratko, M., Habek, N., Kordić, M., Dugandžić, A. The use of infrared technology as a novel approach for studies with female laboratory animals. Croatian Medical Journal. 61 (4), 346-353 (2020).
