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Medicine

非侵襲的微小透析技術 による ラット心臓からの動的連続採血

Published: September 13, 2022
doi:
10.3791/64531
, , , , ,
1School of Pharmacy,Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 2Research Institute of Integrated TCM & Western Medicine,Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 3School of Ethnic Medicine,Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 4Innovative Institute of Chinese Medicine and Pharmacy,Chengdu University of Traditional Chinese Medicine

Summary

本プロトコルは、マイクロダイアリシス技術を用いたラット心臓血液のリアルタイムかつ動的収集のための簡便かつ効率的な方法を記載する。

Abstract

血液成分の動的分析は、心筋梗塞、不整脈、アテローム性動脈硬化症、心原性肺水腫、肺塞栓症、脳塞栓症などの心血管疾患およびそれらに関連する疾患を理解する上で非常に重要です。同時に、生きたラットにおける連続心臓採血技術を突破して、独特の民族医学療法の有効性を評価することが急務である。この研究では、血液微小透析プローブをラットの右頸静脈に正確かつ非侵襲的な外科的処置で移植しました。次に、オンラインマイクロ透析サンプル収集システムに接続することにより、心臓血液サンプルを2.87 nL /分から2.98 mL / minの速度で収集しました。さらに重要なことに、取得した血液サンプルは、4°Cのマイクロ透析容器に一時的に保存できます。 ラット心臓からの微小透析ベースのオンライン連続採血プログラムは、血液サンプルの品質を大幅に保証し、全身性心血管疾患に関する研究の科学的合理性を進歩および活性化し、血液学の観点から民族医学療法を評価しています。

Introduction

生活のペースの加速と心理的圧力の増加に伴い、心血管疾患(CVD)は若年、中年、高齢者に発生する傾向があります1,2。CVDの罹患率と死亡率は高く、急性発症、急速な進行、および病気の長期経過の特徴があり、患者の安全に深刻な影響を及ぼします3。CVDの発生は、コレステロール、血清脂質、血糖値、心筋酵素、プロテインキナーゼK 4,5,6などの一部の血液成分の変化と密接に関連している可能性があります。患者の関連する状況は、定期的な血液検査項目を分析することによって最も迅速に管理することができます。したがって、血液サンプルの品質が検査結果の精度を決定します。しかし、従来の採血方法には避けられない欠点があり、外傷面積が大きい、採血量が少ない、オペレーターの要件が高い、薬物の変化をリアルタイムで反映できない、血液サンプルの前処理が面倒、実験動物の大量消費、動物の倫理要件を満たさないなど、実験結果に深刻な影響を及ぼします7,8,9.医療技術の継続的な進歩に伴い、採血の質もより高い要件を提唱しています。したがって、上記の欠点を克服するための新しい採血技術の開発が急務です。

マイクロ透析は、透析の原則10に基づくin vivoサンプリング技術です。非平衡条件下では、測定される化合物は、濃度勾配に沿って組織から組織に埋め込まれた微小透析プローブに拡散および灌流され、透析液とともに連続的に除去され、生体組織からサンプリングする目的を達成する11、12。従来のサンプリング方法と比較して、マイクロ透析技術は次の点で素晴らしい利点を持っています13,14,15:血液中のさまざまな化合物の変化の継続的なリアルタイム追跡。サンプリングは面倒な前処理を必要とせず、サンプリングサイトでのターゲット化合物の濃度を真に表すことができます。プローブを体のさまざまな部分に埋め込んで、標的化合物の吸収、分布、代謝、排泄、毒性を調べることができます。取得したサンプルには、生物学的高分子(>20 kD)は含まれていません。したがって、高品質の血液サンプルは、CVDと民族医学によって治療されるメカニズムのより良い解釈を保証します。

マイクロ透析サンプリングシステムは、一般に、マイクロインジェクションポンプ、接続チューブ、動物フリームーブメントタンク、マイクロ透析プローブ、およびサンプルコレクター16で構成されています。微小透析システムの装置の最も重要な部分として、一般的な微小透析プローブは、同心プローブ、可撓性プローブ、リニアプローブ、およびシャントプローブ17を備える。これらのうち、フレキシブルプローブは、ソフトで非金属のプローブであり、主に、覚醒し、自由に動く、または麻酔された動物の血管および心臓、筋肉、皮膚、脂肪などの末梢組織からサンプルを収集するために使用される13。血管または組織と接触すると、プローブを柔軟に曲げることができるため、プローブまたはサンプリング部位への不可逆的な損傷を回避できます。プローブ技術の継続的な発展に伴い、さまざまな分野でのマイクロ透析技術の応用も深まっています。この論文では、採血用に設計された柔軟なプローブを介して、非侵襲的マイクロ透析技術によってラットの心臓血液を動的かつ継続的に取得しました。

Protocol

動物プロトコルは、成都中医薬大学の管理委員会によって承認されています(記録番号:2021-11)。特定無病原菌雄性Sprague Dawley(SD)ラット(8-10週,260-300g)を独立した換気ケージで飼育し,実験室環境を22°C,相対湿度65%に維持し,本研究に用いた。動物は商業的な供給源から入手した( 材料表を参照)。すべてのラットは、期間中、遊離水と食事で1週間の適応給餌に慣れていました。 <p class…

Representative Results

本プロトコールにより、意識のあるラットから心臓血液を微小透析装置に設定されたサンプリングパラメータに従って得ることができた。正常な血液サンプルは真っ赤でなければなりませんが、低酸素症、潜在的な血栓、または貧血症の動物は濃い紫色または濃い赤を持っている可能性があります。血液マイクロダイアリシス法で得られたサンプルは無色透明透明で、高速液体クロマトグラ?…

Discussion

CVDは、中国で徐々に発生率が増加している診療所で一般的な慢性疾患であり、発症年齢は若くなる傾向があり、ほとんどの患者の懸念とパニックを引き起こします20,21。世界の主要な死因であるCVDは、脳梗塞やその他の死亡率の高い疾患を誘発し、患者の健康生活を深刻に脅かす可能性があります22。虚血性心疾患、心筋症、アテ?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

この研究は、中国国家自然科学基金会(82104533)、中国ポスドク科学基金会(2020M683273)、四川省科学技術局(2021YJ0175)、および四川省科学技術計画の主要研究開発プロジェクト(2022YFS0438)の支援を受けました。一方、著者らは、TRI-ANGELS D&H TRADING PTEのシニア機器エンジニアであるYuncheng Hong氏に感謝の意を表します。LTD.(シンガポール市、シンガポール)、マイクロダイアリシス技術の技術サービスを提供するため。

Materials

Animal anesthesia system Rayward Life Technology Co., Ltd R500IE
Animal temperature maintainer Rayward Life Technology Co., Ltd 69020
Blood microdialysis probe  CMA Microdialysis AB T55347
Catheter  CMA Microdialysis AB T55347
Citrate Merck Chemical Technology (Shanghai) Co., Ltd 251275
Electric shaver Rayward Life Technology Co., Ltd CP-5200
Fep tubing  CMA Microdialysis AB 3409501
Free movement tank for animals  CMA Microdialysis AB CMA120
Glucose Merck Chemical Technology (Shanghai) Co., Ltd G8270
Hemostatic forceps Rayward Life Technology Co., Ltd F21020-16
Isofluran Rayward Life Technology Co., Ltd R510-22
Micro scissors Beyotime Biotechnology Co., Ltd FS221
Microdialysis collection tube  CMA Microdialysis AB 7431100
Microdialysis collector  CMA Microdialysis AB CMA4004
Microdialysis in vitro stand  CMA Microdialysis AB CMA130
Microdialysis microinjection pump  CMA Microdialysis AB 788130
Microdialysis syringe (1.0 mL)  CMA Microdialysis AB 8309020
Microdialysis tubing adapter  CMA Microdialysis AB 3409500
Microporous filter membrane Merck Millipore Ltd. R0DB36622
Non-absorbable surgical sutures Shanghai Tianqing Biological Materials Co., Ltd S19004
Operating table Yuyan Scientific Instrument Co., Ltd 30153
Ophthalmic forceps Rayward Life Technology Co., Ltd F12016-15
Sodium citrate Merck Chemical Technology (Shanghai) Co., Ltd 1613859
Sprague Dawley  (SD) rats Chengdu Dossy Experimental Animals Co., Ltd SYXK(Equation 1)2019-049
Surgical scissors Rayward Life Technology Co., Ltd S14014-15
Surgical scissors Shanghai Bingyu Fluid technology Co., Ltd BY-103
Syringe needle  CMA Microdialysis AB T55347
Ultrasonic cleaner Guangdong Goote Ultrasonic Co., Ltd KMH1-240W8101
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References

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Hou, Y., Bai, J., Zhang, Y., Meng, X., Zhang, S., Wang, X. Dynamic Continuous Blood Extraction from Rat Heart via Noninvasive Microdialysis Technique. J. Vis. Exp. (187), e64531, doi:10.3791/64531 (2022).
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