Extração Contínua Dinâmica de Sangue do Coração de Rato via Técnica de Microdiálise Não Invasiva
Summary
O presente protocolo descreve um método simples e eficiente para a coleta dinâmica e em tempo real de sangue de coração de ratos utilizando a técnica de microdiálise.
Abstract
A análise dinâmica dos hemocomponentes é de grande importância na compreensão das doenças cardiovasculares e suas doenças relacionadas, como infarto do miocárdio, arritmia, aterosclerose, edema pulmonar cardiogênico, embolia pulmonar e embolia cerebral. Ao mesmo tempo, é urgente romper a técnica de amostragem contínua de sangue cardíaco em ratos vivos para avaliar a eficácia da terapia de medicina étnica distinta. Neste estudo, uma sonda de microdiálise sanguínea foi implantada na veia jugular direita de ratos em um procedimento cirúrgico preciso e não invasivo. Amostras de sangue cardíaco foram então coletadas a uma taxa de 2,87 nL/min a 2,98 mL/min conectando-se a um sistema on-line de coleta de amostras de microdiálise. Ainda mais momentaneamente, as amostras de sangue adquiridas podem ser temporariamente armazenadas em recipientes de microdiálise a 4 °C. O programa on-line de coleta contínua de sangue de coração de rato baseado em microdiálise tem garantido sobremaneira a qualidade das amostras de sangue, avançando e revigorando a racionalidade científica das pesquisas sobre doenças cardiovasculares sistêmicas e avaliando a terapia etnomédica sob a perspectiva da hematologia.
Introduction
Com a aceleração do ritmo de vida e o aumento da pressão psicológica, as doenças cardiovasculares (DCV) tendem a ocorrer em jovens, pessoas de meia-idade e idosos 1,2. A morbidade e a mortalidade das DCV são elevadas, com características de início agudo, rápida progressão e longo curso da doença, o que afeta seriamente a segurança dospacientes3. A ocorrência de DCV pode estar intimamente relacionada às alterações em alguns componentes sanguíneos, como colesterol, lipídios séricos, glicemia, enzimas miocárdicas e proteína quinase K 4,5,6. A situação relevante do paciente pode ser gerenciada mais rapidamente analisando itens de exame de sangue de rotina. Assim, a qualidade das amostras de sangue determina a precisão dos resultados dos testes. No entanto, os métodos convencionais de coleta de sangue apresentam algumas desvantagens inevitáveis, que afetam seriamente os resultados experimentais, tais como grande área de trauma, pequeno volume de coleta de sangue, alta exigência para operadores, incapacidade de refletir mudanças de drogas em tempo real, pré-tratamento pesado de amostras de sangue, grande consumo de animais experimentais e falha em atender aos requisitos éticos dosanimais7,8,9 . Com os avanços contínuos na tecnologia médica, a qualidade da coleta de sangue também impôs exigências mais altas. Portanto, é urgente desenvolver uma nova tecnologia de coleta de sangue para superar as deficiências acima.
A microdiálise é uma técnica de amostragem in vivo baseada nos princípios da diálise10. Em condições de não-equilíbrio, os compostos a serem medidos são difundidos e perfundidos do tecido ao longo do gradiente de concentração para a sonda de microdiálise embebida no tecido no dialisato, que é continuamente removido juntamente com o dialisato, alcançando o objetivo de amostragem do tecido vivo11,12. Comparada aos métodos tradicionais de amostragem, a técnica de microdiálise apresenta vantagens esplêndidas nos seguintes aspectos13,14,15: rastreamento contínuo em tempo real das alterações de vários compostos no sangue; a amostragem não requer pré-processamento tedioso e pode realmente representar a concentração do composto alvo no local de amostragem; sondas podem ser implantadas em diferentes partes do corpo para investigar a absorção, distribuição, metabolismo, excreção e toxicidade dos compostos alvo; a amostra adquirida não contém macromoléculas biológicas (>20 kD). Portanto, as amostras de sangue de maior qualidade garantem uma melhor interpretação das DCV e do mecanismo tratado pela medicina étnica.
Os sistemas de amostragem de microdiálise geralmente consistem em bombas de microinjeção, tubos de conexão, tanques de livre circulação de animais, sondas de microdiálise e coletores de amostras16. Como parte mais crítica do dispositivo do sistema de microdiálise, as sondas comuns de microdiálise compreendem sondas concêntricas, sondas flexíveis, sondas lineares e sonda shunt17. Dentre estas, as sondas flexíveis são sondas macias e não metálicas, utilizadas principalmente para coletar amostras de vasos sanguíneos e tecidos periféricos como coração, músculo, pele e gordura de animais acordados e em movimento livre ou anestesiados13. Quando em contato com vasos sanguíneos ou tecidos, a sonda pode ser flexivelmente dobrada, evitando assim danos irreversíveis à sonda ou ao local de amostragem. Com o desenvolvimento contínuo da tecnologia de sonda, a aplicação da tecnologia de microdiálise em vários campos também está se aprofundando. Neste trabalho, o sangue do coração de ratos foi adquirido de forma dinâmica e contínua pela tecnologia de microdiálise não invasiva através da sonda flexível projetada para coleta de sangue.
Protocol
Representative Results
Discussion
As DCV são uma doença crônica comum nas clínicas, com incidência gradativamente crescente na China, e a idade de início tende a ser mais jovem, causando preocupação e pânico na maioria dospacientes20,21. Sendo a principal causa de morte no mundo, as DCV podem induzir infarto cerebral e outras doenças de alta mortalidade, ameaçando seriamente a vida saudável dos pacientes22. As DCV, incluindo cardiopatia isquêmica, cardiomiopat…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado pela Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (82104533), pela Fundação de Ciência Pós-Doutoral da China (2020M683273), pelo Departamento de Ciência e Tecnologia da província de Sichuan (2021YJ0175) e pelo projeto de P&D chave do Plano Provincial de Ciência e Tecnologia de Sichuan (2022YFS0438). Enquanto isso, os autores gostariam de agradecer ao Sr. Yuncheng Hong, engenheiro de equipamentos sênior da TRI-ANGELS D&H TRADING PTE. (cidade de Cingapura, Cingapura), para prestação de serviços técnicos para técnicas de microdiálise.
Materials
| Animal anesthesia system | Rayward Life Technology Co., Ltd | R500IE | |
| Animal temperature maintainer | Rayward Life Technology Co., Ltd | 69020 | |
| Blood microdialysis probe | CMA Microdialysis AB | T55347 | |
| Catheter | CMA Microdialysis AB | T55347 | |
| Citrate | Merck Chemical Technology (Shanghai) Co., Ltd | 251275 | |
| Electric shaver | Rayward Life Technology Co., Ltd | CP-5200 | |
| Fep tubing | CMA Microdialysis AB | 3409501 | |
| Free movement tank for animals | CMA Microdialysis AB | CMA120 | |
| Glucose | Merck Chemical Technology (Shanghai) Co., Ltd | G8270 | |
| Hemostatic forceps | Rayward Life Technology Co., Ltd | F21020-16 | |
| Isofluran | Rayward Life Technology Co., Ltd | R510-22 | |
| Micro scissors | Beyotime Biotechnology Co., Ltd | FS221 | |
| Microdialysis collection tube | CMA Microdialysis AB | 7431100 | |
| Microdialysis collector | CMA Microdialysis AB | CMA4004 | |
| Microdialysis in vitro stand | CMA Microdialysis AB | CMA130 | |
| Microdialysis microinjection pump | CMA Microdialysis AB | 788130 | |
| Microdialysis syringe (1.0 mL) | CMA Microdialysis AB | 8309020 | |
| Microdialysis tubing adapter | CMA Microdialysis AB | 3409500 | |
| Microporous filter membrane | Merck Millipore Ltd. | R0DB36622 | |
| Non-absorbable surgical sutures | Shanghai Tianqing Biological Materials Co., Ltd | S19004 | |
| Operating table | Yuyan Scientific Instrument Co., Ltd | 30153 | |
| Ophthalmic forceps | Rayward Life Technology Co., Ltd | F12016-15 | |
| Sodium citrate | Merck Chemical Technology (Shanghai) Co., Ltd | 1613859 | |
| Sprague Dawley (SD) rats | Chengdu Dossy Experimental Animals Co., Ltd | SYXK( )2019-049 |
|
| Surgical scissors | Rayward Life Technology Co., Ltd | S14014-15 | |
| Surgical scissors | Shanghai Bingyu Fluid technology Co., Ltd | BY-103 | |
| Syringe needle | CMA Microdialysis AB | T55347 | |
| Ultrasonic cleaner | Guangdong Goote Ultrasonic Co., Ltd | KMH1-240W8101 |
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