비침습적 미세투석 기술을 통한 쥐 심장의 동적 연속 혈액 추출
Summary
본 프로토콜은 미세투석 기술을 사용하여 쥐 심장 혈액의 실시간 및 동적 수집을 위한 간단하고 효율적인 방법을 설명한다.
Abstract
혈액 성분의 동적 분석은 심근 경색, 부정맥, 죽상 동맥 경화증, 심인성 폐부종, 폐색전증 및 뇌색전증과 같은 심혈관 질환 및 관련 질병을 이해하는 데 매우 중요합니다. 동시에, 독특한 민족 의학 요법의 효과를 평가하기 위해 살아있는 쥐에서 지속적인 심장 혈액 샘플링 기술을 돌파하는 것이 시급합니다. 이 연구에서는 정확하고 비침습적인 수술 절차로 쥐의 오른쪽 경정맥에 혈액 미세 투석 프로브를 이식했습니다. 그런 다음 온라인 미세 투석 샘플 수집 시스템에 연결하여 2.87nL/min에서 2.98mL/min의 속도로 심장 혈액 샘플을 수집했습니다. 더욱 중요한 것은 획득된 혈액 샘플을 4°C의 미세 투석 용기에 임시로 보관할 수 있다는 것입니다. 쥐 심장의 미세 투석 기반 온라인 연속 채혈 프로그램은 혈액 샘플의 품질을 크게 보장하여 전신 심혈관 질환 연구의 과학적 합리성을 발전시키고 활성화하며 혈액학의 관점에서 민족 의학 요법을 평가합니다.
Introduction
삶의 속도가 빨라지고 심리적 압박이 증가함에 따라 심혈관 질환 (CVD)은 젊은이, 중년 및 노인에서 발생하는 경향이 있습니다 1,2. CVD의 이환율과 사망률은 높으며, 급성 발병, 빠른 진행, 긴 질병 경과 등의 특징이 있어 환자의 안전에 심각한 영향을 미친다3. CVD의 발생은 콜레스테롤, 혈청 지질, 혈당, 심근 효소 및 단백질 키나아제 K 4,5,6과 같은 일부 혈액 성분의 변화와 밀접한 관련이 있을 수 있습니다. 환자의 관련 상황은 일상적인 혈액 검사 항목을 분석하여 가장 빠르게 관리 할 수 있습니다. 따라서 혈액 샘플의 품질에 따라 검사 결과의 정확도가 결정됩니다. 그러나, 종래의 채혈 방법은 몇 가지 불가피한 단점을 가지고 있으며, 이는 큰 외상 부위, 작은 혈액 수집량, 작업자에 대한 높은 요구 사항, 실시간으로 약물 변화를 반영 할 수 없음, 번거로운 혈액 샘플 전처리, 실험 동물의 대량 소비 및 동물 윤리적 요구 사항을 충족시키지 못하는 것과 같은 실험 결과에 심각한 영향을 미친다 7,8,9 . 의료 기술의 지속적인 발전으로 채혈의 품질도 더 높은 요구 사항을 제시했습니다. 따라서 상기와 같은 단점을 극복하기 위해 새로운 혈액 샘플링 기술을 개발하는 것이 시급하다.
미세투석(Microdialysis)은 투석 원리10에 기초한 생체 내 샘플링 기술이다. 비평형 조건 하에서, 측정될 화합물은 농도 구배를 따라 조직으로부터 투석액 내로 조직 내에 내장된 미세 투석 프로브 내로 확산 및 관류되고, 투석액과 함께 연속적으로 제거되어, 생체 조직으로부터 샘플링하는 목적을 달성한다(11,12). 전통적인 샘플링 방법과 비교하여, 미세 투석 기술은 다음과 같은 측면에서 훌륭한 이점을 갖는다13,14,15 : 혈액 내 다양한 화합물의 변화에 대한 지속적인 실시간 추적; 샘플링은 지루한 전처리가 필요하지 않으며 샘플링 현장에서 표적 화합물의 농도를 진정으로 나타낼 수 있습니다. 프로브는 표적 화합물의 흡수, 분포, 대사, 배설 및 독성을 조사하기 위해 신체의 다른 부분에 이식될 수 있습니다. 획득 한 샘플에는 생물학적 거대 분자 (>20 kD)가 포함되어 있지 않습니다. 따라서 고품질 혈액 샘플은 CVD와 민족 의학으로 치료되는 메커니즘에 대한 더 나은 해석을 보장합니다.
미세 투석 샘플링 시스템은 일반적으로 미세 주입 펌프, 연결 튜브, 동물이 없는 이동 탱크, 미세 투석 프로브 및 샘플 수집기로 구성된다16. 미세 투석 시스템의 장치의 가장 중요한 부분으로서, 일반적인 미세 투석 프로브는 동심 프로브, 플렉시블 프로브, 선형 프로브 및 션트 프로브(17)를 포함한다. 이 중에서, 플렉시블 프로브는 연질 및 비금속 프로브로서, 주로 깨어 있거나 자유롭게 움직이거나 마취된 동물의 혈관 및 심장, 근육, 피부 및 지방과 같은 말초 조직으로부터 샘플을 수집하는데 사용된다13. 혈관이나 조직과 접촉할 때 프로브를 유연하게 구부릴 수 있으므로 프로브 또는 샘플링 부위에 돌이킬 수 없는 손상을 방지할 수 있습니다. 프로브 기술의 지속적인 발전으로 다양한 분야에서 미세 투석 기술의 적용도 심화되고 있습니다. 본 논문에서는 채혈을 위해 설계된 플렉시블 프로브를 통해 비침습적 미세투석 기술로 쥐의 심장 혈액을 역동적이고 지속적으로 획득하였다.
Protocol
Representative Results
Discussion
CVD는 중국에서 발병률이 점차 증가하는 클리닉에서 흔한 만성 질환이며 발병 연령이 젊어지는 경향이 있어 대부분의 환자의 우려와 공황을 유발합니다20,21. CVD는 전 세계 주요 사망 원인이기 때문에 뇌경색 및 기타 사망률이 높은 질환을 유발하여 환자의 건강한 삶을 심각하게 위협할 수 있다22. 허혈성 심장 질환, 심근 병증, 죽상 동?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작업은 중국 국립 자연 과학 재단(82104533), 중국 박사후 과학 재단(2020M683273), 쓰촨성 과학 기술부(2021YJ0175) 및 쓰촨성 과학 기술 계획의 핵심 R&D 프로젝트(2022YFS0438)의 지원을 받았습니다. 한편, 저자들은 TRI-ANGELS D&H TRADING PTE의 수석 장비 엔지니어인 Yuncheng Hong에게 감사의 말을 전하고 싶습니다. LTD. (싱가포르 시, 싱가포르), 미세 투석 기술에 대한 기술 서비스 제공.
Materials
| Animal anesthesia system | Rayward Life Technology Co., Ltd | R500IE | |
| Animal temperature maintainer | Rayward Life Technology Co., Ltd | 69020 | |
| Blood microdialysis probe | CMA Microdialysis AB | T55347 | |
| Catheter | CMA Microdialysis AB | T55347 | |
| Citrate | Merck Chemical Technology (Shanghai) Co., Ltd | 251275 | |
| Electric shaver | Rayward Life Technology Co., Ltd | CP-5200 | |
| Fep tubing | CMA Microdialysis AB | 3409501 | |
| Free movement tank for animals | CMA Microdialysis AB | CMA120 | |
| Glucose | Merck Chemical Technology (Shanghai) Co., Ltd | G8270 | |
| Hemostatic forceps | Rayward Life Technology Co., Ltd | F21020-16 | |
| Isofluran | Rayward Life Technology Co., Ltd | R510-22 | |
| Micro scissors | Beyotime Biotechnology Co., Ltd | FS221 | |
| Microdialysis collection tube | CMA Microdialysis AB | 7431100 | |
| Microdialysis collector | CMA Microdialysis AB | CMA4004 | |
| Microdialysis in vitro stand | CMA Microdialysis AB | CMA130 | |
| Microdialysis microinjection pump | CMA Microdialysis AB | 788130 | |
| Microdialysis syringe (1.0 mL) | CMA Microdialysis AB | 8309020 | |
| Microdialysis tubing adapter | CMA Microdialysis AB | 3409500 | |
| Microporous filter membrane | Merck Millipore Ltd. | R0DB36622 | |
| Non-absorbable surgical sutures | Shanghai Tianqing Biological Materials Co., Ltd | S19004 | |
| Operating table | Yuyan Scientific Instrument Co., Ltd | 30153 | |
| Ophthalmic forceps | Rayward Life Technology Co., Ltd | F12016-15 | |
| Sodium citrate | Merck Chemical Technology (Shanghai) Co., Ltd | 1613859 | |
| Sprague Dawley (SD) rats | Chengdu Dossy Experimental Animals Co., Ltd | SYXK( )2019-049 |
|
| Surgical scissors | Rayward Life Technology Co., Ltd | S14014-15 | |
| Surgical scissors | Shanghai Bingyu Fluid technology Co., Ltd | BY-103 | |
| Syringe needle | CMA Microdialysis AB | T55347 | |
| Ultrasonic cleaner | Guangdong Goote Ultrasonic Co., Ltd | KMH1-240W8101 |
References
- van Rensburg, W. J. J. Post-mortem evidence of a diverse distribution pattern of atherosclerosis in the South African population. Scientific Reports. 12 (1), 11366 (2022).
- Katz, A. J., Chen, R. C., Usinger, D. S., Danus, S. M., Zullig, L. L. Cardiovascular disease prevention and management of pre-existent cardiovascular disease in a cohort of prostate cancer survivors. Journal of Cancer Survivorship. , (2022).
- Rødevand, L., Tesli, M., Andreassen, O. A. Cardiovascular disease risk in people with severe mental disorders: an update and call for action. Current Opinion in Psychiatry. 35 (4), 277-284 (2022).
- Izumi, Y., et al. Impact of circulating cathepsin K on the coronary calcification and the clinical outcome in chronic kidney disease patients. Heart and Vessels. 31 (1), 6-14 (2016).
- Wang, K., et al. Whey protein hydrolysate alleviated atherosclerosis and hepatic steatosis by regulating lipid metabolism in apoE-/- mice fed a Western diet. Food Research International. 157, 111419 (2022).
- Angelone, T., Rocca, C., Pasqua, T. Nesfatin-1 in cardiovascular orchestration: From bench to bedside. Pharmacological Research. 156, 104766 (2020).
- Bernardi, P. M., Barreto, F., Dalla Costa, T. Application of a LC-MS/MS method for evaluating lung penetration of tobramycin in rats by microdialysis. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 134, 340-345 (2017).
- Anderzhanova, E., Wotjak, C. T. Brain microdialysis and its applications in experimental neurochemistry. Cell and Tissue Research. 354 (1), 27-39 (2013).
- Joukhadar, C., Müller, M. Microdialysis: current applications in clinical pharmacokinetic studies and its potential role in the future. Clinical Pharmacokinetics. 44 (9), 895-913 (2005).
- Stangler, L. A., et al. Microdialysis and microperfusion electrodes in neurologic disease monitoring. Fluids and Barriers of the CNS. 18 (1), 52 (2021).
- Young, B., et al. Cerebral microdialysis. Critical Care Nursing Clinics of North America. 28 (1), 109-124 (2016).
- O’Connell, M. T., Krejci, J. Microdialysis techniques and microdialysis-based patient-near diagnostics. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 414 (10), 3165-3175 (2022).
- Hammarlund-Udenaes, M. Microdialysis as an important technique in systems pharmacology-a historical and methodological review. The AAPS Journal. 19 (5), 1294-1303 (2017).
- Stahl, M., Bouw, R., Jackson, A., Pay, V. Human microdialysis. Current Pharmaceutical Biotechnology. 3 (2), 165-178 (2002).
- Pierce, C. F., Kwasnicki, A., Lakka, S. S., Engelhard, H. H. Cerebral microdialysis as a tool for assessing the delivery of chemotherapy in brain tumor patients. World Neurosurgery. 145, 187-196 (2021).
- Sørensen, M., Jacobsen, S., Petersen, L. Microdialysis in equine research: a review of clinical and experimental findings. Veterinary Journal. 197 (3), 553-559 (2013).
- Dmitrieva, N., Rodríguez-Malaver, A. J., Pérez, J., Hernández, L. Differential release of neurotransmitters from superficial and deep layers of the dorsal horn in response to acute noxious stimulation and inflammation of the rat paw. European Journal of Pain. 8 (3), 245-252 (2004).
- Li, T., et al. Microdialysis sampling and HPLC-MS/MS quantification of sinomenine, ligustrazine, gabapentin, paracetamol, pregabalin and amitriptyline in rat blood and brain extracellular fluid. Acta Pharmaceutica Sinica. 55 (9), 2198-2206 (2020).
- Chauzy, A., Lamarche, I., Adier, C., Couet, W., Marchand, S. Microdialysis study of Aztreonam-Avibactam distribution in peritoneal fluid and muscle of rats with or without experimental peritonitis. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 62 (10), 01228 (2018).
- Fang, X. X., Ardehali, H., Min, J. X., Wang, F. D. The molecular and metabolic landscape of iron and ferroptosis in cardiovascular disease. Nature Reviews. Cardiology. , 1-17 (2022).
- Samson, R., Ennezat, P. V., Le Jemtel, T. H., Oparil, S. Cardiovascular disease risk reduction and body mass index. Current Hypertension Reports. , (2022).
- Kim, M. H., et al. School racial segregation and long-term cardiovascular health among Black adults in the US: A quasi-experimental study. PLoS Medicine. 19 (6), 1004031 (2022).
- Qin, Y. H., et al. Role of m6A RNA methylation in cardiovascular disease (Review). International Journal of Molecular Medicine. 46 (6), 1958-1972 (2020).
- Xu, C. M., Liu, C. J., Xiong, J. H., Yu, J. Cardiovascular aspects of the (pro)renin receptor: Function and significance. FASEB Journal. 36 (4), 22237 (2022).
- Guvenc-Bayram, G., Yalcin, M. The intermediary role of the central cyclooxygenase / lipoxygenase enzymes in intracerebroventricular injected nesfatin-1-evoked cardiovascular effects in rats. Neuroscience Letters. 756, 135961 (2021).
- Ahrens Kress, A. P., Zhang, Y. D., Kaiser-Vry, A. R., Sauer, M. B. A comparison of blood collection techniques in mice and their effects on welfare. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 61 (3), 287-295 (2022).
- Joshi, A., Patel, H., Joshi, A., Stagni, G. Pharmacokinetic applications of cutaneous microdialysis: Continuous+intermittent vs continuous-only sampling. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 83, 16-20 (2017).
- Reyes-Garcés, N., et al. In vivo brain sampling using a microextraction probe reveals metabolic changes in rodents after deep brain stimulation. Analytical Chemistry. 91 (15), 9875-9884 (2019).
- Kho, C. M., Enche Ab Rahim, S. K., Ahmad, Z. A., Abdullah, N. S. A review on microdialysis calibration methods: the theory and current related efforts. Molecular Neurobiology. 54 (5), 3506-3527 (2017).
- Zhuang, L. N., et al. Theory and application of microdialysis in pharmacokinetic studies. Current Drug Metabolism. 16 (10), 919-931 (2015).
- Zhang, Y. F., Huang, X. X., Zhu, L. X. Metabonomics research strategy based on microdialysis technique. China Journal of Chinese Materia Medica. 45 (1), 214-220 (2020).
- Carpenter, K. L., Young, A. M., Hutchinson, P. J. Advanced monitoring in traumatic brain injury: microdialysis. Current Opinion in Critical Care. 23 (2), 103-109 (2017).
- Brunner, M., Langer, O. Microdialysis versus other techniques for the clinical assessment of in vivo tissue drug distribution. The AAPS Journal. 8 (2), 263-271 (2006).
- Tettey-Amlalo, R. N., Kanfer, I., Skinner, M. F., Benfeldt, E., Verbeeck, R. K. Application of dermal microdialysis for the evaluation of bioequivalence of a ketoprofen topical gel. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 36 (2-3), 219-225 (2009).
- Dhanani, J. A., et al. Recovery rates of combination antibiotic therapy using in vitro microdialysis simulating in vivo conditions. Journal of Pharmaceutical Analysis. 8 (6), 407-412 (2018).
