Оценка токсичности, ассоциированной с Т-клетками химерного антигенного рецептора, с использованием мышиной модели ксенотрансплантата пациента с острым лимфобластным лейкозом

Summary

В данной статье мы опишем протокол, в котором модель ксенотрансплантата пациента с острым лимфобластным лейкозом используется в качестве стратегии для оценки и мониторинга токсичности, ассоциированной с Т-клетками рецептора химерного антигена CD19.

Abstract

Клеточная терапия химерным антигенным рецептором Т (CART) стала мощным инструментом для лечения нескольких типов злокачественных опухолей CD19⁺ , что привело к недавнему одобрению FDA нескольких методов клеточной терапии CD19-таргетной CART (CART19). Тем не менее, клеточная терапия CART связана с уникальным набором токсичных веществ, которые несут в себе свою заболеваемость и смертность. К ним относятся синдром высвобождения цитокинов (CRS) и нейровоспаление (NI). Использование доклинических мышиных моделей имеет решающее значение в исследованиях и разработках технологии CART для оценки как эффективности CART, так и токсичности CART. Доступные доклинические модели для тестирования этой адоптивной клеточной иммунотерапии включают сингенные, ксенотрансплантатные, трансгенные и гуманизированные мышиные модели. Не существует единой модели, которая бы органично отражала иммунную систему человека, и у каждой модели есть сильные и слабые стороны. Целью данной работы по методам является описание модели ксенотрансплантата пациента с использованием лейкозных бластов пациентов с острым лимфобластным лейкозом в качестве стратегии оценки токсичности, ассоциированной с CART19, CRS и NI. Было показано, что эта модель повторяет токсичность, связанную с CART19, а также терапевтическую эффективность, наблюдаемую в клинике.

Introduction

Клеточная терапия химерным антигенным рецептором Т (CART) произвела революцию в области иммунотерапии рака. Он доказал свою эффективность в лечении рецидивирующего/рефрактерного острого лимфобластного лейкоза (ОЛЛ), крупноклеточной В-клеточной лимфомы, мантийноклеточной лимфомы, фолликулярной лимфомы и множественной миеломы 1,2,3,4,5,6,7^, что привело к недавним одобрениям FDA. Несмотря на первоначальный успех в клинических испытаниях, лечение клеточной терапией CART приводит к токсичности, которая часто бывает тяжелой, а иногда и летальной. Наиболее распространенные токсичные явления после клеточной терапии CART включают развитие CRS и NI, также называемого синдромом нейротоксичности, ассоциированным с иммунными эффекторными клетками (ICANS)^8,9. CRS вызывается гиперактивацией и массивной экспансией клеток CART in vivo, что приводит к последующей секреции нескольких воспалительных цитокинов, включая интерферон-γ, фактор некроза опухоли-α, гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (GM-CSF) и интерлейкин-6 (IL-6). Это приводит к гипотонии, высокой температуре, синдрому капиллярной утечки, дыхательной недостаточности, полиорганной недостаточности, а в некоторых случаях и к смерти^10,11. СВК развивается в 50-100% случаев после клеточной терапии CART19^11,12,13. ICANS является еще одним уникальным нежелательным явлением, связанным с клеточной терапией CART, и характеризуется генерализованным отеком головного мозга, спутанностью сознания, обтукцией, афазией, двигательной слабостью, а иногда и судорогами ^9,14. Любая степень ICANS встречается у 70% пациентов, а степени 3-4 отмечаются у 20-30% пациентов 5,10,15,16. В целом, CRS и ICANS являются распространенными и могут привести к летальному исходу.

Ведение ICANS после клеточной терапии CART является сложной задачей. У большинства пациентов с ICANS также наблюдается СВК¹⁷, который часто можно лечить антагонистом рецепторов IL-6 тоцилизумабом или стероидами¹⁸. Предыдущее сообщение показало, что раннее вмешательство с применением тоцилизумаба снижает частоту тяжелого СВК, но не влияет на частоту или тяжесть ICANS¹⁹. В настоящее время не существует эффективного лечения или профилактического средства для ИКАНС, и крайне важно исследовать профилактические стратегии²⁰.

Считается, что миелоидные клетки и связанные с ними цитокины/хемокины являются основными драйверами развития CRS и ICANS²¹. В то время как CRS напрямую связан с экстремальным повышением цитокинов и экспансией Т-клеток, патофизиология ICANS в значительной степени неизвестна^22,23. Таким образом, крайне важно создать мышиную модель, которая повторяет эти токсичности после клеточной терапии CART, чтобы изучить механизмы и разработать профилактические стратегии.

В настоящее время существует множество доклинических моделей на животных, используемых для изучения, оптимизации и проверки эффективности клеток CART, а также для мониторинга связанной с ними токсичности. К ним относятся сингенные, ксенотрансплантатные, иммунокомпетентные трансгенные, гуманизированные трансгенные и полученные от пациентов ксенотрансплантаты мышей, а также модели приматов. Тем не менее, каждая из этих моделей имеет недостатки, и некоторые из них не отражают истинную эффективность или безопасность клеток CART^24,25. Поэтому крайне важно тщательно выбирать оптимальную модель для предполагаемых целей исследования.

В данной статье предпринята попытка описать методологию, используемую для оценки токсичности, ассоциированной с клетками CART, CRS и NI, с использованием модели ксенотрансплантата in vivo, полученного от пациента (PDX) in vivo (рис. 1). В частности, в описанных здесь методах используются клетки CART19, полученные в лаборатории авторов, по ранее описанным протоколам. Вкратце, Т-клетки человека выделяют из мононуклеарных клеток периферической крови здорового донора (PBMC) с помощью метода градиента плотности, стимулируют шариками CD3/CD28 на 0-й день и лентививически трансдуцируют на 1-й день с помощью CAR, состоящего из одноцепочечного вариабельного фрагмента, нацеленного на CD19, слитого с сигнальными доменами 4-1BB и CD3ζ. Затем эти клетки CART расширяют, очищают от шариков на 6-й день и криоконсервируют на 8-й день 26,27,28,29,30. Как указывалось ранее, мышей подвергают лимфодеплетирующему лечению, за которым следует введение лейкозных бластов (ОЛЛ)²⁸. Во-первых, приживление опухоли проверяется с помощью подчелюстного забора крови. После установления соответствующей опухолевой нагрузки мышам вводят клетки CART19. Затем мышей ежедневно взвешивают, чтобы оценить их самочувствие. Магнитно-резонансная томография (МРТ) мелких животных проводится для оценки NI, а также хвостового кровотечения для оценки роста Т-клеток и продукции цитокинов/хемокинов. Методы, описанные ниже, настоятельно рекомендуется использовать в качестве модели для изучения токсичности, ассоциированной с клетками CART, в модели PDX.

Protocol

Этот протокол соответствует рекомендациям Институционального наблюдательного совета (IRB) клиники Майо, Институционального комитета по уходу за животными и их использованию (IACUC A00001767) и Институционального комитета по биобезопасности (IBC, Bios00000006.04). ПРИМЕЧАНИЕ: Все матери?…

Representative Results

Целью данного протокола является оценка токсичности, ассоциированной с клетками CART, с использованием модели мышей PDX из опухолевых клеток пациентов с ОЛЛ (рис. 1). Во-первых, мышам NSG вводили внутривенно бусульфан (30 мг/кг) с целью иммуносупрессии и облегчения приживления ?…

Discussion

В настоящем отчете описана методология оценки токсичности, ассоциированной с клетками CART, с использованием модели ALL PDX. В частности, эта модель стремится имитировать две опасные для жизни токсичности, CRS и NI, которые пациенты часто испытывают после инфузии клеток CART. Он повторяет многие…

Materials

APC Anti-Human CD19	Biolegend	302211
Alcohol Prep Pad	Wecol	6818
Analyze 14.0 software	AnalyzeDirect Inc.	N/A	https://analyzedirect.com/analyze14/
Artificial tears (Mineral oil and petrolatum)	Akorn	17478-062-35	Topical ophtalmic gel to prevent eye dryness
BD FACS Lysing Solution	BD	349202	Red blood cells lysing buffer
BD Micro-Fin IV insulin syringes	BD	329461
Brillian Violet 421 Anti-Human CD45	Biolegend	304032
Bruker Avance II 7 Tesla	Bruker Biospin	N/A	MRI machine
Busulfan (NSC-750)	Selleckchem	S1692
CountBright absolute counting beads	Invitrogen	C36950
CytoFLEX System B4-R2-V2	Beckman Coulter	C10343	flow cytometer
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline	Gibco	14190-144
ERT Control/Gating Module	SA Instruments	Model 1030	Small Animal Monitoring Respiratory and Gating System
Fetal bovine serum	Millipore Sigma	F8067
Hemocytometer	Bright-Line	Z359629-1EA
Human AB Serum; Male Donors; type AB; US	Corning	35-060-CI
Isoflurane (Liquid)	Sigma-Aldrich	792632
LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit, for 405 nm excitation	Invitrogen	L34966
Microvette 500 Lithium heparin	Sarstedt	20.1345.100	Blood collection tube
MILLIPLEX Huma/Cytokine/Chemokine Magnetic Beads Panel	Millipore Sigma	HCYTMAG-60K-PX38	Immunology Multiplex Assay to identify cytokines and chemokines
Omniscan	Ge Healthcare Inc.	0407-0690-10	Gadolinium-based constrast agent
Pd Anti-Mouse CD45	Biolegend	103106
Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100x), Liquid	Gibco	10378-016
Round Bottom Polysterene Test tube	Corning	352008
Sodium Azide, 5% (w/v)	Ricca Chemical	7144.8-16
Stainless Steel Surgical Blade	Bard-Parker	371215
X-VIVO 15 Serum-free Hematopoietic Cell Medium	Lonza	04-418Q