Bewertung der chimären Antigenrezeptor-T-Zell-assoziierten Toxizität unter Verwendung eines Xenograft-Mausmodells für Patienten mit akuter lymphatischer Leukämie

Summary

In dieser Arbeit beschreiben wir ein Protokoll, in dem ein von Patienten mit akuter lymphatischer Leukämie abgeleitetes Xenograft-Modell als Strategie zur Bewertung und Überwachung von CD19-gerichteten chimären Antigenrezeptor-T-Zell-assoziierten Toxizitäten verwendet wird.

Abstract

Die chimäre Antigenrezeptor-T-Zelltherapie (CART) hat sich zu einem leistungsstarken Werkzeug für die Behandlung mehrerer Arten von CD19⁺ -Malignomen entwickelt, was kürzlich zur FDA-Zulassung mehrerer CD19-gerichteter CART-Zelltherapien (CART19) geführt hat. Die CART-Zelltherapie ist jedoch mit einer einzigartigen Reihe von Toxizitäten verbunden, die ihre eigene Morbidität und Mortalität mit sich bringen. Dazu gehören das Zytokin-Freisetzungssyndrom (CRS) und die Neuroinflammation (NI). Die Verwendung präklinischer Mausmodelle war für die Forschung und Entwicklung der CART-Technologie von entscheidender Bedeutung, um sowohl die Wirksamkeit von CARTs als auch die Toxizität von CARTs zu bewerten. Zu den verfügbaren präklinischen Modellen zur Erprobung dieser adoptiven zellulären Immuntherapie gehören syngene, xenotransplantierte, transgene und humanisierte Mausmodelle. Es gibt kein einzelnes Modell, das das menschliche Immunsystem nahtlos widerspiegelt, und jedes Modell hat Stärken und Schwächen. Diese Methodenarbeit zielt darauf ab, ein von Patienten abgeleitetes Xenotransplantatmodell zu beschreiben, das leukämische Blasten von Patienten mit akuter lymphatischer Leukämie als Strategie zur Bewertung von CART19-assoziierten Toxizitäten, CRS und NI verwendet. Es hat sich gezeigt, dass dieses Modell sowohl die CART19-assoziierten Toxizitäten als auch die therapeutische Wirksamkeit in der Klinik rekapituliert.

Introduction

Die chimäre Antigenrezeptor-T-Zelltherapie (CART) hat die Krebsimmuntherapie revolutioniert. Es hat sich als erfolgreich bei der Behandlung von rezidivierter/refraktärer akuter lymphatischer Leukämie (ALL), großzelligem B-Zell-Lymphom, Mantelzell-Lymphom, follikulärem Lymphom und multiplem Myelom 1,2,3,4,5,6,7 erwiesen^, was zu den jüngsten FDA-Zulassungen geführt hat. Trotz der anfänglichen Erfolge in klinischen Studien führt die Behandlung mit der CART-Zelltherapie zu Toxizitäten, die oft schwerwiegend und gelegentlich tödlich sind. Zu den häufigsten Toxizitäten nach CART-Zelltherapie gehört die Entwicklung von CRS und NI, die auch als Immuneffektorzell-assoziiertes Neurotoxizitätssyndrom (ICANS) bezeichnet ^werden8,9. CRS wird durch die Überaktivierung und massive Expansion von CART-Zellen in vivo verursacht, was zur anschließenden Sekretion mehrerer inflammatorischer Zytokine führt, darunter Interferon-γ, Tumornekrosefaktor-α, Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierender Faktor (GM-CSF) und Interleukin-6 (IL-6). Dies führt zu Hypotonie, hohem Fieber, Kapillarlecksyndrom, Atemversagen, Multiorganversagen und in einigen Fällen zum Tod^10,11. CRS entwickelt sich in 50-100% der Fälle nach CART19-Zelltherapie^11,12,13. ICANS ist ein weiteres einzigartiges unerwünschtes Ereignis im Zusammenhang mit der CART-Zelltherapie und ist gekennzeichnet durch generalisierte Hirnödeme, Verwirrtheit, Benommenheit, Aphasie, motorische Schwäche und gelegentlich Krampfanfälle ^9,14. Jeder Grad von ICANS tritt bei bis zu 70 % der Patienten auf, und die Grade 3-4 werden bei 20-30 % der Patienten berichtet 5,10,15,16. Insgesamt sind CRS und ICANS weit verbreitet und können tödlich sein.

Die Behandlung von ICANS nach einer CART-Zelltherapie ist eine Herausforderung. Bei den meisten Patienten mit ICANS kommt es auch zu CRS¹⁷, das häufig mit dem IL-6-Rezeptorantagonisten Tocilizumab oder Steroiden¹⁸ behandelt werden kann. Ein früherer Bericht zeigte, dass eine frühzeitige Intervention mit Tocilizumab die Rate des schweren CRS verringerte, aber keinen Einfluss auf die Inzidenz oder den Schweregrad von ICANS^{hatte 19}. Derzeit gibt es keine wirksame Behandlung oder Prophylaxe für ICANS, und es ist von entscheidender Bedeutung, Präventionsstrategien zu untersuchen²⁰.

Es wird angenommen, dass myeloische Zellen und assoziierte Zytokine/Chemokine die Haupttreiber für die Entwicklung von CRS und ICANS^{sind 21}. Während CRS in direktem Zusammenhang mit der extremen Erhöhung der Zytokine und der T-Zell-Expansion steht, ist die Pathophysiologie von ICANS weitgehend unbekannt^22,23. Daher ist es zwingend erforderlich, ein Mausmodell zu etablieren, das diese Toxizitäten nach der CART-Zelltherapie rekapituliert, um die Mechanismen zu untersuchen und Präventionsstrategien zu entwickeln.

Derzeit gibt es mehrere präklinische Tiermodelle, die zur Untersuchung, Optimierung und Validierung der Wirksamkeit von CART-Zellen sowie zur Überwachung der damit verbundenen Toxizitäten verwendet werden. Dazu gehören syngene, xenotransplantierte, immunkompetente transgene, humanisierte transgene und patientenabgeleitete Xenotransplantat-Mäuse sowie Primatenmodelle. Jedes dieser Modelle hat jedoch Nachteile, und einige spiegeln nicht die tatsächliche Wirksamkeit oder Sicherheitsbedenken von CART-Zellen wider^24,25. Daher ist es unerlässlich, das beste Modell für die beabsichtigten Ziele der Studie sorgfältig auszuwählen.

In diesem Artikel wird versucht, die Methodik zu beschreiben, die zur Bewertung von CART-Zell-assoziierten Toxizitäten, CRS und NI, unter Verwendung eines ALL-patientenabgeleiteten Xenotransplantats (PDX) in vivo verwendet wird (Abbildung 1). Konkret werden bei den hier beschriebenen Methoden CART19-Zellen verwendet, die im Labor der Autoren nach zuvor beschriebenen Protokollen erzeugt wurden. Kurz gesagt, menschliche T-Zellen werden mit Hilfe einer Dichtegradiententechnik aus gesunden mononukleären Zellen des peripheren Blutes (PBMCs) des Spenders isoliert, an Tag 0 mit CD3/CD28-Kügelchen stimuliert und an Tag 1 mit CARs lentiviral transduziert, die aus einem CD19-gerichteten einkettigen variablen Fragment bestehen, das mit 4-1BB- und CD3ζ-Signaldomänen fusioniert ist. Diese CART-Zellen werden dann expandiert, am Tag 6 entkläutet und am Tag 8 kryokonserviert 26,27,28,29,30. Wie bereits erwähnt, werden die Mäuse einer lymphodepletierenden Behandlung unterzogen, gefolgt von der Verabreichung von patienteneigenen leukämischen Blasten (ALL)²⁸. Zunächst wird die Tumortransplantation durch submandibuläre Blutentnahme überprüft. Nach Etablierung einer entsprechenden Tumorlast werden den Mäusen CART19-Zellen verabreicht. Dann werden die Mäuse täglich gewogen, um das Wohlbefinden zu beurteilen. Die Kleintier-Magnetresonanztomographie (MRT) wird durchgeführt, um die NI zu beurteilen, zusammen mit Schwanzblutungen, um die T-Zell-Expansion und die Zytokin-/Chemokinproduktion zu beurteilen. Die unten beschriebenen Techniken werden dringend empfohlen, um als Modell zur Untersuchung von CART-Zell-assoziierten Toxizitäten in einem PDX-Modell verwendet zu werden.

Protocol

Dieses Protokoll folgt den Richtlinien des Institutional Review Board (IRB), des Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC A00001767) und des Institutional Biosafety Committee (IBC, Bios00000006.04) der Mayo Clinic. HINWEIS: Alle Materialien, die für die Arbeit mit Mäusen verwendet werden, müssen steril sein. 1. Injektion von Busulfan an NSG-Mäuse Besorgen Sie sich männliche, 8-12 Wochen alte, immungeschwächte NOD-SCID IL2r?…

Representative Results

Das Ziel dieses Protokolls ist es, CART-Zell-assoziierte Toxizitäten anhand eines PDX-Mausmodells aus Tumorzellen von Patienten mit ALL zu bewerten (Abbildung 1). Zunächst erhielten NSG-Mäuse i.p. Injektionen von Busulfan (30 mg/kg) mit dem Ziel, sie immunsupprimieren und die Transplantation von CART-Zellen zu erleichtern28. Am nächsten Tag erhielten sie ~5 × 106 PBMCs (i.v.), die von ALLEN Patienten stammten. Die Mäuse wurden ~13 Wochen lang mit<…

Discussion

In diesem Bericht wurde eine Methodik zur Bewertung von CART-Zell-assoziierten Toxizitäten unter Verwendung eines ALL-PDX-Modells beschrieben. Genauer gesagt versucht dieses Modell, zwei lebensbedrohliche Toxizitäten, CRS und NI, nachzuahmen, die Patienten häufig nach der Infusion von CART-Zellen erleben. Es rekapituliert viele Kennzeichen von CART-Toxizitäten, die in der Klinik beobachtet wurden: Gewichtsverlust, motorische Dysfunktion, Neuroinflammation, entzündliche Zytokin- und Chemokinproduktion und die Infiltr…

Materials

APC Anti-Human CD19	Biolegend	302211
Alcohol Prep Pad	Wecol	6818
Analyze 14.0 software	AnalyzeDirect Inc.	N/A	https://analyzedirect.com/analyze14/
Artificial tears (Mineral oil and petrolatum)	Akorn	17478-062-35	Topical ophtalmic gel to prevent eye dryness
BD FACS Lysing Solution	BD	349202	Red blood cells lysing buffer
BD Micro-Fin IV insulin syringes	BD	329461
Brillian Violet 421 Anti-Human CD45	Biolegend	304032
Bruker Avance II 7 Tesla	Bruker Biospin	N/A	MRI machine
Busulfan (NSC-750)	Selleckchem	S1692
CountBright absolute counting beads	Invitrogen	C36950
CytoFLEX System B4-R2-V2	Beckman Coulter	C10343	flow cytometer
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline	Gibco	14190-144
ERT Control/Gating Module	SA Instruments	Model 1030	Small Animal Monitoring Respiratory and Gating System
Fetal bovine serum	Millipore Sigma	F8067
Hemocytometer	Bright-Line	Z359629-1EA
Human AB Serum; Male Donors; type AB; US	Corning	35-060-CI
Isoflurane (Liquid)	Sigma-Aldrich	792632
LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit, for 405 nm excitation	Invitrogen	L34966
Microvette 500 Lithium heparin	Sarstedt	20.1345.100	Blood collection tube
MILLIPLEX Huma/Cytokine/Chemokine Magnetic Beads Panel	Millipore Sigma	HCYTMAG-60K-PX38	Immunology Multiplex Assay to identify cytokines and chemokines
Omniscan	Ge Healthcare Inc.	0407-0690-10	Gadolinium-based constrast agent
Pd Anti-Mouse CD45	Biolegend	103106
Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100x), Liquid	Gibco	10378-016
Round Bottom Polysterene Test tube	Corning	352008
Sodium Azide, 5% (w/v)	Ricca Chemical	7144.8-16
Stainless Steel Surgical Blade	Bard-Parker	371215
X-VIVO 15 Serum-free Hematopoietic Cell Medium	Lonza	04-418Q