Avaliação das Toxicidades Associadas às Células T do Receptor de Antígeno Quimérico Usando um Modelo de Xenoenxerto de Camundongo Derivado de Pacientes com Leucemia Linfoblástica Aguda

Summary

Aqui, descrevemos um protocolo no qual um modelo de xenoenxerto derivado de pacientes com leucemia linfoblástica aguda é usado como estratégia para avaliar e monitorar as toxicidades associadas ao receptor de antígeno quimérico CD19-alvo.

Abstract

A terapia celular com receptor de antígeno quimérico T (CART) emergiu como uma ferramenta poderosa para o tratamento de vários tipos de malignidades CD19⁺ , o que levou à recente aprovação pelo FDA de várias terapias celulares CART direcionadas para CD19 (CART19). No entanto, a terapia celular CART está associada a um conjunto único de toxicidades que carregam sua própria morbidade e mortalidade. Isso inclui a síndrome de liberação de citocinas (SRC) e a neuroinflamação (NI). O uso de modelos pré-clínicos em camundongos tem sido crucial na pesquisa e desenvolvimento da tecnologia CART para avaliar tanto a eficácia quanto a toxicidade da CART. Os modelos pré-clínicos disponíveis para testar essa imunoterapia celular adotiva incluem modelos de camundongos singênicos, xenoenxertos, transgênicos e humanizados. Não há um modelo único que espelhe perfeitamente o sistema imunológico humano, e cada modelo tem pontos fortes e fracos. Este artigo tem como objetivo descrever um modelo de xenoenxerto derivado de pacientes usando blastos leucêmicos de pacientes com leucemia linfoblástica aguda como estratégia para avaliar toxicidades associadas à CART19, RSC e NI. Demonstrou-se que esse modelo recapitula as toxicidades associadas à CART19, bem como a eficácia terapêutica observada na clínica.

Introduction

A terapia celular com receptor de antígeno quimérico T (CART) revolucionou o campo da imunoterapia contra o câncer. Provou ser bem-sucedida no tratamento da leucemia linfoblástica aguda (LLA) recidivante/refratária, linfoma de grandes células B, linfoma de células do manto, linfoma folicular e mieloma múltiplo1,2,3,4,5,6,7^, levando a recentes aprovações do FDA. Apesar do sucesso inicial nos ensaios clínicos, o tratamento com terapia celular CART resulta em toxicidades muitas vezes graves e ocasionalmente letais. As toxicidades mais comuns após a terapia celular com CART incluem o desenvolvimento de RN e RN, também conhecida como síndrome de neurotoxicidade associada a células efetoras imunes (ICANS)^8,9. A RSC é causada devido à superativação e expansão maciça das células CART in vivo, levando à secreção subsequente de múltiplas citocinas inflamatórias, incluindo interferon-γ, fator de necrose tumoral-α, fator estimulador de colônias de granulócitos e macrófagos (GM-CSF) e interleucina-6 (IL-6). Isso resulta em hipotensão, febre alta, síndrome de extravasamento capilar, insuficiência respiratória, falência de múltiplos órgãos e, em alguns casos, morte^10,11. A RSC desenvolve-se em 50-100% dos casos após terapia celular com CART19^11,12,13. A ICANS é outro evento adverso único associado à terapia celular com CART e é caracterizada por edema cerebral generalizado, confusão, obnubilação, afasia, fraqueza motora e, ocasionalmente, convulsões ^9,14. Qualquer grau de ICANS ocorre em até 70% dos pacientes, e os graus 3-4 são relatados em 20-30% dos pacientes 5,10,15,16. Em geral, a SRC e a ICANS são comuns e podem ser fatais.

O manejo da ICANS após a terapia celular com CART é desafiador. A maioria dos pacientes com ICANS também apresenta RSC¹⁷, que muitas vezes pode ser tratada com o antagonista do receptor de IL-6 tocilizumabe ou esteroides¹⁸. Um relato anterior revelou que a intervenção precoce com tocilizumabe diminuiu a taxa de RSC grave, mas não afetou a incidência ou a gravidade da ICANS¹⁹. Atualmente, não há tratamento efetivo ou agente profilático para o ICANS, sendo crucial investigar estratégias^{preventivas 20}.

Acredita-se que as células mieloides e as citocinas/quimiocinas associadas sejam os principais impulsionadores do desenvolvimento da RSC e ICANS²¹. Enquanto a RSC está diretamente relacionada à elevação extrema de citocinas e expansão de células T, a fisiopatologia da ICANS é amplamente desconhecida^22,23. Portanto, é imperativo estabelecer um modelo de camundongo que recapitule essas toxicidades após a terapia celular com CART para estudar os mecanismos e desenvolver estratégias preventivas.

Existem vários modelos animais pré-clínicos atualmente usados para estudar, otimizar e validar a eficácia de células CART, bem como para monitorar suas toxicidades associadas. Estes incluem camundongos singênicos, xenoenxertos, transgênicos imunocompetentes, transgênicos humanizados e xenoenxertos derivados de pacientes, além de modelos de primatas. No entanto, cada um desses modelos apresenta desvantagens, e alguns não refletem as verdadeiras preocupações de eficácia ou segurança das células CART^24,25. Portanto, é imperativo a escolha criteriosa do melhor modelo para os objetivos pretendidos do estudo.

Este artigo procura descrever a metodologia utilizada para avaliar a toxicidade associada às células CART, RNC e NI, utilizando um modelo in vivo de xenoenxerto derivado de ALL (PDX) (Figura 1). Especificamente, nos métodos aqui descritos, as células CART19 geradas em nosso laboratório são utilizadas seguindo protocolos previamente descritos. Resumidamente, as células T humanas são isoladas de células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) de doadores saudáveis por meio de uma técnica de gradiente de densidade, estimuladas com esferas CD3/CD28 no dia 0 e transduzidas lentiviricamente no dia 1 com CARs compostas por um fragmento variável de cadeia única direcionado para CD19 fundido aos domínios de sinalização 4-1BB e CD3ζ. Essas células CART são então expandidas, desfrisadas no 6º dia e criopreservadas no 8º dia 26,27,28,29,30. Como descrito anteriormente, camundongos são submetidos a tratamento linfodepletante, seguido pela administração de blastos leucêmicos derivados do paciente (LLA)²⁸. Primeiro, verifica-se a enxertia tumoral por meio da coleta de sangue submandibular. Após o estabelecimento de uma carga tumoral apropriada, as células CART19 são administradas aos camundongos. Em seguida, os ratos são pesados diariamente para avaliar o bem-estar. A ressonância magnética (RM) de pequenos animais é realizada para avaliar a infecção hospitalar, juntamente com o sangramento da cauda para avaliar a expansão de células T e a produção de citocinas/quimiocinas. As técnicas descritas abaixo são altamente recomendadas para serem usadas como modelo para estudar toxicidades associadas a células CART em um modelo PDX.

Protocol

Este protocolo segue as diretrizes do Comitê de Ética em Pesquisa (CEP) da Mayo Clinic, Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC A00001767) e Comitê Institucional de Biossegurança (IBC, Bios00000006.04). NOTA: Todos os materiais utilizados para trabalhar com ratos devem ser estéreis. 1. Injeção de bussulfano em camundongos NSG Obter camundongos machos, 8-12 semanas de idade, imunocomprometidos, NOD-SCID IL2rγnull (…

Representative Results

O objetivo deste protocolo é avaliar a toxicidade associada às células CART usando um modelo PDX de células tumorais de pacientes com LLA (Figura 1). Primeiro, camundongos NSG receberam injeções i.p. de bussulfano (30 mg/kg) com o objetivo de imunossuprimi-los e facilitar o enxerto de células CART28. No dia seguinte, receberam ~5 × 106 PBMCs (i.v.) derivados de TODOS os pacientes. Os camundongos foram monitorados para enxerto por ~13 semanas atr…

Discussion

Neste relatório, uma metodologia para avaliar a toxicidade associada a células CART usando um modelo ALL PDX foi descrita. Mais especificamente, este modelo procura mimetizar duas toxicidades potencialmente fatais, RSC e NI, que os pacientes frequentemente experimentam após a infusão de células CART. Ela recapitula muitas características das toxicidades da CART observadas na clínica: perda de peso, disfunção motora, neuroinflamação, produção de citocinas inflamatórias e quimiocinas e infiltração de difere…

Materials

APC Anti-Human CD19	Biolegend	302211
Alcohol Prep Pad	Wecol	6818
Analyze 14.0 software	AnalyzeDirect Inc.	N/A	https://analyzedirect.com/analyze14/
Artificial tears (Mineral oil and petrolatum)	Akorn	17478-062-35	Topical ophtalmic gel to prevent eye dryness
BD FACS Lysing Solution	BD	349202	Red blood cells lysing buffer
BD Micro-Fin IV insulin syringes	BD	329461
Brillian Violet 421 Anti-Human CD45	Biolegend	304032
Bruker Avance II 7 Tesla	Bruker Biospin	N/A	MRI machine
Busulfan (NSC-750)	Selleckchem	S1692
CountBright absolute counting beads	Invitrogen	C36950
CytoFLEX System B4-R2-V2	Beckman Coulter	C10343	flow cytometer
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline	Gibco	14190-144
ERT Control/Gating Module	SA Instruments	Model 1030	Small Animal Monitoring Respiratory and Gating System
Fetal bovine serum	Millipore Sigma	F8067
Hemocytometer	Bright-Line	Z359629-1EA
Human AB Serum; Male Donors; type AB; US	Corning	35-060-CI
Isoflurane (Liquid)	Sigma-Aldrich	792632
LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit, for 405 nm excitation	Invitrogen	L34966
Microvette 500 Lithium heparin	Sarstedt	20.1345.100	Blood collection tube
MILLIPLEX Huma/Cytokine/Chemokine Magnetic Beads Panel	Millipore Sigma	HCYTMAG-60K-PX38	Immunology Multiplex Assay to identify cytokines and chemokines
Omniscan	Ge Healthcare Inc.	0407-0690-10	Gadolinium-based constrast agent
Pd Anti-Mouse CD45	Biolegend	103106
Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100x), Liquid	Gibco	10378-016
Round Bottom Polysterene Test tube	Corning	352008
Sodium Azide, 5% (w/v)	Ricca Chemical	7144.8-16
Stainless Steel Surgical Blade	Bard-Parker	371215
X-VIVO 15 Serum-free Hematopoietic Cell Medium	Lonza	04-418Q