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Cancer Research

急性リンパ芽球性白血病患者由来異種移植マウスモデルを用いたキメラ抗原受容体T細胞関連毒性の評価

Published: February 10, 2023
doi:
10.3791/64535
, , , , , , , ,
1T Cell Engineering Laboratory,Mayo Clinic, Rochester, 2Division of Hematology,Mayo Clinic, Rochester, 3Mayo Clinic Graduate School of Biomedical Sciences,Mayo Clinic, Rochester, 4Department of Molecular Medicine,Mayo Clinic, Rochester, 5Regenerative Sciences PhD Program,Mayo Clinic, Rochester, 6Department of Immunology,Mayo Clinic, Rochester

Summary

ここでは、急性リンパ芽球性白血病患者由来の異種移植片モデルを、CD19標的キメラ抗原受容体T細胞関連毒性を評価および監視するための戦略として使用するプロトコルについて説明します。

Abstract

キメラ抗原受容体T(CART)細胞療法は、複数のタイプのCD19+ 悪性腫瘍を治療するための強力なツールとして登場し、最近、いくつかのCD19標的CART(CART19)細胞療法のFDA承認につながっています。ただし、CART細胞療法は、独自の罹患率と死亡率を伴う独自の毒性のセットに関連しています。これには、サイトカイン放出症候群(CRS)および神経炎症(NI)が含まれます。前臨床マウスモデルの使用は、CARTの有効性とCART毒性の両方を評価するためのCART技術の研究開発において非常に重要です。この養子細胞免疫療法をテストするために利用可能な前臨床モデルには、同系、異種移植片、トランスジェニック、およびヒト化マウスモデルが含まれます。人間の免疫システムをシームレスに反映する単一のモデルはなく、各モデルには長所と短所があります。この論文は、CART19関連毒性、CRS、およびNIを評価するための戦略として、急性リンパ芽球性白血病患者からの白血病芽球を使用した患者由来の異種移植片モデルを説明することを目的としています。このモデルは、クリニックで見られるように、CART19関連の毒性と治療効果を再現することが示されています。

Introduction

キメラ抗原受容体T(CART)細胞療法は、がん免疫療法の分野に革命をもたらしました。再発/難治性の急性リンパ芽球性白血病(ALL)、大細胞型B細胞リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、および多発性骨髄腫の治療に成功することが証明されており、最近のFDA承認につながっています。臨床試験での最初の成功にもかかわらず、CART細胞療法による治療は、しばしば重篤で時には致命的な毒性をもたらします。CART細胞療法後の最も一般的な毒性には、免疫エフェクター細胞関連神経毒性症候群(ICANS)とも呼ばれるCRSおよびNIの発症が含まれます8,9。CRSは、in vivoでのCART細胞の過剰活性化と大規模な増殖によって引き起こされ、その後、インターフェロンγ、腫瘍壊死因子-α、顆粒球-マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF)、およびインターロイキン-6(IL-6)を含む複数の炎症性サイトカインの分泌につながります。これは、低血圧、高熱、毛細血管漏出症候群、呼吸不全、多臓器不全、そして場合によっては死に至る10,11をもたらします。CRSは、CART19細胞療法後の症例の50〜100%で発症する11、12、13。ICANSは、CART細胞療法に関連する別のユニークな有害事象であり、全身性脳浮腫、混乱、鈍化、失語症、運動衰弱、そして時には発作を特徴としています9,14。ICANSのどのグレードも患者の最大70%で発生し、グレード3〜4は患者の20〜30%で報告されています5、10、15、16。全体として、CRSとICANSは一般的であり、致命的となる可能性があります。

CART細胞療法後のICANSの管理は困難です。ICANSのほとんどの患者はCRS17も経験し、IL-6受容体拮抗薬トシリズマブまたはステロイド18で治療できることがよくあります。以前の報告では、トシリズマブの早期介入は重症CRSの発生率を低下させたが、ICANS19の発生率または重症度には影響しなかったことが明らかになった。現在、ICANSに対する有効な治療法や予防薬は存在せず、予防戦略を検討することが重要です20。

骨髄系細胞および関連するサイトカイン/ケモカインは、CRSおよびICANS21の開発の主な推進力であると考えられています。CRSはサイトカインの極端な上昇とT細胞増殖に直接関係していますが、ICANSの病態生理はほとんど知られていません22,23。したがって、CART細胞療法後のこれらの毒性を再現するマウスモデルを確立し、メカニズムを研究し、予防戦略を開発することが不可欠です。

現在、CART細胞の有効性を研究、最適化、検証し、関連する毒性を監視するために使用されている複数の前臨床動物モデルがあります。これらには、霊長類モデルに加えて、同系、異種移植片、免疫適格トランスジェニック、ヒト化トランスジェニック、および患者由来の異種移植片マウスが含まれる。しかしながら、これらのモデルの各々は欠点を有し、そしていくつかはCART細胞の真の有効性または安全性の懸念を反映していない24、25。したがって、研究の意図された目的に最適なモデルを慎重に選択することが不可欠です。

この記事では、ALL患者由来の異種移植片(PDX)in vivoモデルを使用して、CART細胞関連毒性であるCRSおよびNIを評価するために使用される方法論について説明します(図1)。具体的には、ここに記載の方法では、著者らの研究室で作製したCART19細胞を、前述のプロトコールに従って使用する。簡単に説明すると、ヒトT細胞は、密度勾配法を介して健康なドナー末梢血単核細胞(PBMC)から単離され、0日目にCD3 / CD28ビーズで刺激され、1日目に4-1BBおよびCD3ζシグナル伝達ドメインに融合したCD19標的一本鎖可変断片で構成されるCARでレンチウイルス形質導入されます。次に、これらのCART細胞を増殖させ、6日目にビーズを除去し、8日目に凍結保存します26、27、28、29、30日目。先に概説したように、マウスはリンパ球枯渇治療を受け、続いて患者由来の白血病芽球(ALL)を投与される28。まず、腫瘍の生着が顎下採血によって検証されます。適切な腫瘍量の確立に続いて、CART19細胞をマウスに投与する。次に、マウスの体重を毎日測定して、健康状態を評価します。小動物磁気共鳴画像法(MRI)は、T細胞の増殖とサイトカイン/ケモカイン産生を評価するために尾部出血とともにNIを評価するために実行されます。以下に説明する手法は、PDXモデルでCART細胞関連毒性を研究するためのモデルとして使用することを強くお勧めします。

Protocol

このプロトコルは、メイヨークリニックの治験審査委員会(IRB)、施設動物の管理および使用委員会(IACUC A00001767)、および施設バイオセーフティ委員会(IBC、Bios00000006.04)のガイドラインに従います。 注:マウスを扱うために使用されるすべての材料は無菌でなければなりません。 1. NSGマウスへのブスルファン注射 8〜12週齢の雄、免疫?…

Representative Results

このプロトコルの目的は、ALL患者の腫瘍細胞からのPDXマウスモデルを使用してCART細胞関連毒性を評価することです(図1)。まず、NSGマウスにブスルファン(30 mg/kg)のi.p.注射を行い、免疫抑制とCART細胞の生着促進を目的として投与しました28。翌日、彼らはすべての患者に由来する106 PBMC (i.v.)×~5を受け取りました。マウスは、尾出血アッセイ ?…

Discussion

本報告では、ALL PDXモデルを用いてCART細胞関連毒性を評価する方法論について述べる。より具体的には、このモデルは、患者がCART細胞の注入後にしばしば経験する2つの生命を脅かす毒性、CRSおよびNIを模倣しようとしています。これは、クリニックで観察されたCART毒性の多くの特徴を要約します:体重減少、運動機能障害、神経炎症、炎症性サイトカインおよびケモカイン産生、および中<sup …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

この作業の一部は、国立衛生研究所(R37CA266344、1K99CA273304)、国防総省(CA201127)、メイヨークリニックK2Rパイプライン(S.S.K.)、メイヨークリニック個別化医療センター(S.S.K.)、およびプレドリン財団(R.L.S.)を通じて支援されました。また、メイヨークリニックNMRコア施設のスタッフにも感謝申し上げます。 図 1 は BioRender.com で作成されたものです

Materials

 APC Anti-Human CD19 Biolegend 302211
Alcohol Prep Pad Wecol 6818
Analyze 14.0 software AnalyzeDirect Inc. N/A https://analyzedirect.com/analyze14/
Artificial tears (Mineral oil and petrolatum) Akorn 17478-062-35 Topical ophtalmic gel to prevent eye dryness
BD FACS Lysing Solution  BD 349202 Red blood cells lysing buffer
BD Micro-Fin IV insulin syringes BD 329461
Brillian Violet 421 Anti-Human CD45 Biolegend 304032
Bruker Avance II 7 Tesla  Bruker Biospin N/A MRI machine
Busulfan (NSC-750) Selleckchem S1692
CountBright absolute counting beads Invitrogen C36950
CytoFLEX System B4-R2-V2 Beckman Coulter C10343 flow cytometer
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline Gibco 14190-144 
ERT Control/Gating Module  SA Instruments Model 1030 Small Animal Monitoring Respiratory and Gating System
Fetal bovine serum Millipore Sigma F8067
Hemocytometer Bright-Line Z359629-1EA
Human AB Serum; Male Donors; type AB; US Corning 35-060-CI
Isoflurane (Liquid) Sigma-Aldrich 792632
LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit, for 405 nm excitation Invitrogen L34966
Microvette 500 Lithium heparin Sarstedt 20.1345.100 Blood collection tube
MILLIPLEX Huma/Cytokine/Chemokine Magnetic Beads Panel Millipore Sigma HCYTMAG-60K-PX38 Immunology Multiplex Assay to identify cytokines and chemokines
Omniscan Ge Healthcare Inc. 0407-0690-10 Gadolinium-based constrast agent
Pd Anti-Mouse CD45 Biolegend 103106
Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100x), Liquid Gibco 10378-016
Round Bottom Polysterene Test tube Corning 352008
Sodium Azide, 5% (w/v) Ricca Chemical 7144.8-16
Stainless Steel Surgical Blade Bard-Parker 371215
X-VIVO 15 Serum-free Hematopoietic Cell Medium Lonza 04-418Q
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Manriquez Roman, C., Sakemura, R. L., Kimball, B. L., Jin, F., Khadka, R. H., Adada, M. M., Siegler, E. L., Johnson, A. J., Kenderian, S. S. Assessment of Chimeric Antigen Receptor T Cell-Associated Toxicities Using an Acute Lymphoblastic Leukemia Patient-Derived Xenograft Mouse Model. J. Vis. Exp. (192), e64535, doi:10.3791/64535 (2023).
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