ここでは、急性リンパ芽球性白血病患者由来の異種移植片モデルを、CD19標的キメラ抗原受容体T細胞関連毒性を評価および監視するための戦略として使用するプロトコルについて説明します。
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この記事について
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サマリー
要約
キメラ抗原受容体T(CART)細胞療法は、複数のタイプのCD19+ 悪性腫瘍を治療するための強力なツールとして登場し、最近、いくつかのCD19標的CART(CART19)細胞療法のFDA承認につながっています。ただし、CART細胞療法は、独自の罹患率と死亡率を伴う独自の毒性のセットに関連しています。これには、サイトカイン放出症候群(CRS)および神経炎症(NI)が含まれます。前臨床マウスモデルの使用は、CARTの有効性とCART毒性の両方を評価するためのCART技術の研究開発において非常に重要です。この養子細胞免疫療法をテストするために利用可能な前臨床モデルには、同系、異種移植片、トランスジェニック、およびヒト化マウスモデルが含まれます。人間の免疫システムをシームレスに反映する単一のモデルはなく、各モデルには長所と短所があります。この論文は、CART19関連毒性、CRS、およびNIを評価するための戦略として、急性リンパ芽球性白血病患者からの白血病芽球を使用した患者由来の異種移植片モデルを説明することを目的としています。このモデルは、クリニックで見られるように、CART19関連の毒性と治療効果を再現することが示されています。
概要
キメラ抗原受容体T(CART)細胞療法は、がん免疫療法の分野に革命をもたらしました。再発/難治性の急性リンパ芽球性白血病(ALL)、大細胞型B細胞リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、および多発性骨髄腫の治療に成功することが証明されており、最近のFDA承認につながっています。臨床試験での最初の成功にもかかわらず、CART細胞療法による治療は、しばしば重篤で時には致命的な毒性をもたらします。CART細胞療法後の最も一般的な毒性には、免疫エフェクター細胞関連神経毒性症候群(ICANS)とも呼ばれるCRSおよびNIの発症が含まれます8,9。CRSは、in vivoでのCART細胞の過剰活性化と大規模な増殖によって引き起こされ、その後、インターフェロンγ、腫瘍壊死因子-α、顆粒球-マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF)、およびイ....
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プロトコル
このプロトコルは、メイヨークリニックの治験審査委員会(IRB)、施設動物の管理および使用委員会(IACUC A00001767)、および施設バイオセーフティ委員会(IBC、Bios00000006.04)のガイドラインに従います。
注:マウスを扱うために使用されるすべての材料は無菌でなければなりません。
1. NSGマウスへのブスルファン注射
- 8〜12週齢の雄、免疫不全のNOD-SCID IL2rγnull(NSG)マウスを入手し、注射前に体重を測定します。
注:統計的有意性のために、グループごとに少なくとも5匹のマウスを使用し、メスマウスでこの実験を少なくとももう一度繰り返すことをお勧めします。 - 腹腔内(i.p.)注射用のブスルファンを準備します。1 mLのインスリンシリンジを使用して、シリンジに正確に30 mg / kgのブスルファンをゆっくりと注意深く満たし、続いてマウスにi.p注射し、ケージに戻します。
2.NSGマウスへのすべての患者由来芽球(CD19+)の注射
注:このプロトコルは、メイヨークリニックの施設バイオセーフティ委員会(IBC、Bios000000....
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結果
このプロトコルの目的は、ALL患者の腫瘍細胞からのPDXマウスモデルを使用してCART細胞関連毒性を評価することです(図1)。まず、NSGマウスにブスルファン(30 mg/kg)のi.p.注射を行い、免疫抑制とCART細胞の生着促進を目的として投与しました28。翌日、彼らはすべての患者に由来する106 PBMC (i.v.)×~5を受け取りました。マウスは、尾出血アッセイ を介して ~13週間生着についてモニターされました。赤血球を回収し、溶解し、続いてフローサイトメトリー調製物を用いて、CD19+ 腫瘍細胞の発現を評価した(図2)。
マウスが≥10腫瘍細胞/μLに達したら、それらを無作為化し、4×106 CART19細胞(i.v.)を受け取るように準備した。CART19関連毒性を評価するために、マウスを1日1回体重を測定した(
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ディスカッション
本報告では、ALL PDXモデルを用いてCART細胞関連毒性を評価する方法論について述べる。より具体的には、このモデルは、患者がCART細胞の注入後にしばしば経験する2つの生命を脅かす毒性、CRSおよびNIを模倣しようとしています。これは、クリニックで観察されたCART毒性の多くの特徴を要約します:体重減少、運動機能障害、神経炎症、炎症性サイトカインおよびケモカイン産生、および中枢神経系へのさまざまなエフェクター細胞の浸潤8,20,28。これまで、このPDXモデルは、CRSとNIの初期開発を模倣し(表1)、毒性の予防と治療のためのさまざまな戦略を評価するために使用されていました。このPDXモデルにおける1つの研究では、GM-CSFが枯渇したCART19細胞を利用した。より具体的には、これらの結果は、GM−CSF枯渇がCRS結合サイトカインおよびケモカインの分泌減少をもたらすことを実証し、これは、このALLPDXマウスモ.......
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開示事項
S.S.K.は、CAR免疫療法の分野における特許の発明者であり、ノバルティス(メイヨークリニック、ペンシルベニア大学、ノバルティスの間の契約を通じて)およびメッタフォージ(メイヨークリニックを通じて)にライセンス供与されています。R.L.S.とS.S.K.は、ヒューマニジェンにライセンス供与されているCAR免疫療法の分野における特許の発明者です。S.S.K.は、Kite、Gilead、Juno、Celgene、Novartis、Humanigen、MorphoSys、Tolero、Sunesis、Leahlabs、Lentigenから研究資金を受けています。
謝辞
この作業の一部は、国立衛生研究所(R37CA266344、1K99CA273304)、国防総省(CA201127)、メイヨークリニックK2Rパイプライン(S.S.K.)、メイヨークリニック個別化医療センター(S.S.K.)、およびプレドリン財団(R.L.S.)を通じて支援されました。また、メイヨークリニックNMRコア施設のスタッフにも感謝申し上げます。 図 1 は BioRender.com で作成されたものです
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| APC Anti-Human CD19 | Biolegend | 302211 | |
| Alcohol Prep Pad | Wecol | 6818 | |
| Analyze 14.0 software | AnalyzeDirect Inc. | N/A | https://analyzedirect.com/analyze14/ |
| 人工涙液(鉱物油とワセリン) | Akorn | 17478-062-35 | 眼の乾燥を防ぐ局所眼薬ジェル |
| BD FACS Lysing Solution | BD | 349202 | 赤血球溶解バッファー |
| BD Micro-Fin IV インスリン注射器 | BD | 329461 | |
| Brillian Violet 421 Anti-Human CD45 | Biolegend | 304032 | |
| Bruker Avance II 7 Tesla | Bruker Biospin | N/A | MRIマシン |
| Busulfan (NSC-750) | Selleckchem | S1692 | |
| CountBright absolute counting beads | Invitrogen | C36950 | |
| CytoFLEX System B4-R2-V2 | Beckman Coulter | C10343 | flow cytometer |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline | Gibco | 14190-144 | |
| ERT制御/ゲーティングモジュール | SAインスツルメンツ | モデル1030 | 小動物モニタリング 呼吸器およびゲーティングシステム |
| ウシ胎児血清 | ミリポアシグマ | F8067 | |
| 血球計算盤 | ブライトライン | Z359629-1EA | |
| ヒトAB血清;男性ドナー;タイプAB;US | Corning | 35-060-CI | |
| イソフルラン (液体) | Sigma-Aldrich | 792632 | |
| LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit, for 405 nm excitation | Invitrogen | L34966 | |
| Microvette 500 Lithium heparin | Sarstedt | 20.1345.100 | 採血管 |
| MILLIPLEX Huma/Cytokine/Chemokine 磁気ビーズ パネル | ミリポア Sigma | HCYTMAG-60K-PX38 | サイトカインとケモカインを同定するための免疫学マルチプレックスアッセイ |
| Omniscan | Ge Healthcare Inc. | 0407-0690-10 | ガドリニウムベースのコンストラストエージェント |
| Pd 抗マウス CD45 | バイオレジェンド | 103106 | |
| ペニシリン-ストレプトマイシン-グルタミン (100x)、液体 | Gibco | 10378-016 | |
| 丸底ポリステレン試験管 | コーニング | 352008 | |
| アジ化ナトリウム、5% (w/v) | リッカ ケミカル | 7144.8-16 | |
| ステンレス鋼外科用ブレードバード | パーカー | 371215 | |
| X-VIVO 15無血清造血細胞培地 | ザ | 04-418Q |
参考文献
- Turtle, C. J., et al. Immunotherapy of non-Hodgkin's lymphoma with a defined ratio of CD8+ and CD4+ CD19-specific chimeric antigen receptor-modified T cells. Science Translational Medicine. 8 (355), (2016).
- Kochenderfer, J. N., et al.
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再版と許可
訂正
Formal Correction: Erratum: Assessment of Chimeric Antigen Receptor T Cell-Associated Toxicities Using an Acute Lymphoblastic Leukemia Patient-derived Xenograft Mouse Model
Posted by JoVE Editors on 3/14/2023. Citeable Link.
An erratum was issued for: Assessment of Chimeric Antigen Receptor T Cell-Associated Toxicities Using an Acute Lymphoblastic Leukemia Patient-derived Xenograft Mouse Model. The Authors section was updated from:
Claudia Manriquez Roman1,2,3,4,5
R. Leo Sakemura1,2
Fang Jin6
Roman H. Khadka6
Mohamad M. Adada1,2
Elizabeth L. Siegler1,2
Aaron J. Johnson6
Saad S. Kenderian1,2,6
1T Cell Engineering Laboratory, Mayo Clinic, Rochester,
2Division of Hematology, Mayo Clinic, Rochester,
3Mayo Clinic Graduate School of Biomedical Sciences, Mayo Clinic, Rochester,
4Department of Molecular Medicine, Mayo Clinic, Rochester,
5Regenerative Sciences PhD Program, Mayo Clinic, Rochester,
6Department of Immunology, Mayo Clinic, Rochester
to:
Claudia Manriquez Roman1,2,3,4,5
R. Leo Sakemura1,2
Brooke L. Kimball1,2
Fang Jin6
Roman H. Khadka6
Mohamad M. Adada1,2
Elizabeth L. Siegler1,2
Aaron J. Johnson6
Saad S. Kenderian1,2,6
1T Cell Engineering Laboratory, Mayo Clinic, Rochester,
2Division of Hematology, Mayo Clinic, Rochester,
3Mayo Clinic Graduate School of Biomedical Sciences, Mayo Clinic, Rochester,
4Department of Molecular Medicine, Mayo Clinic, Rochester,
5Regenerative Sciences PhD Program, Mayo Clinic, Rochester,
6Department of Immunology, Mayo Clinic, Rochester
