एक तीव्र लिम्फोब्लास्टिक ल्यूकेमिया रोगी-व्युत्पन्न जेनोग्राफ्ट माउस मॉडल का उपयोग करके चिमेरिक एंटीजन रिसेप्टर टी सेल-संबद्ध विषाक्तता का आकलन
Summary
यहां, हम एक प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं जिसमें एक तीव्र लिम्फोब्लास्टिक ल्यूकेमिया रोगी-व्युत्पन्न जेनोग्राफ्ट मॉडल का उपयोग सीडी 19-लक्षित चिमेरिक एंटीजन रिसेप्टर टी सेल से जुड़े विषाक्त पदार्थों का आकलन और निगरानी करने के लिए एक रणनीति के रूप में किया जाता है।
Abstract
चिमेरिक एंटीजन रिसेप्टर टी (सीएआरटी) सेल थेरेपी कई प्रकार की सीडी 19 + विकृतियों के उपचार के लिए एक शक्तिशाली उपकरण के रूप में उभरी है, जिसके कारण हाल ही में कई सीडी 19-लक्षित कार्ट (सीएआरटी 19) सेल थेरेपी के एफडीए अनुमोदन हुए हैं। हालांकि, कार्ट सेल थेरेपी विषाक्तता के एक अद्वितीय सेट से जुड़ी है जो अपनी रुग्णता और मृत्यु दर को वहन करती है। इसमें साइटोकिन रिलीज सिंड्रोम (सीआरएस) और न्यूरोइन्फ्लेमेशन (एनआई) शामिल हैं। सीएआरटी प्रभावकारिता और कार्ट विषाक्तता दोनों का आकलन करने के लिए कार्ट प्रौद्योगिकी के अनुसंधान और विकास में प्रीक्लिनिकल माउस मॉडल का उपयोग महत्वपूर्ण रहा है। इस दत्तक सेलुलर इम्यूनोथेरेपी का परीक्षण करने के लिए उपलब्ध प्रीक्लिनिकल मॉडल में सिंजेनिक, जेनोग्राफ्ट, ट्रांसजेनिक और मानवकृत माउस मॉडल शामिल हैं। कोई भी मॉडल नहीं है जो मानव प्रतिरक्षा प्रणाली को मूल रूप से प्रतिबिंबित करता है, और प्रत्येक मॉडल में ताकत और कमजोरियां हैं। इस विधि पत्र का उद्देश्य सीएआरटी 19 से जुड़े विषाक्तताओं, सीआरएस और एनआई का आकलन करने की रणनीति के रूप में तीव्र लिम्फोब्लास्टिक ल्यूकेमिया वाले रोगियों से ल्यूकेमिक विस्फोटों का उपयोग करके रोगी-व्युत्पन्न जेनोग्राफ्ट मॉडल का वर्णन करना है। इस मॉडल को कार्ट 19 से जुड़े विषाक्त पदार्थों के साथ-साथ चिकित्सीय प्रभावकारिता को पुन: उत्पन्न करने के लिए दिखाया गया है जैसा कि क्लिनिक में देखा गया है।
Introduction
चिमेरिक एंटीजन रिसेप्टर टी (सीएआरटी) सेल थेरेपी ने कैंसर इम्यूनोथेरेपी के क्षेत्र में क्रांति ला दी है। दुर्दम्य तीव्र लिम्फोब्लास्टिक ल्यूकेमिया (एएलएल), बड़े बी सेल लिम्फोमा, मेंटल सेल लिम्फोमा, कूपिक लिंफोमा और मल्टीपल मायलोमा 1,2,3,4,5,6,7 के इलाज में सफल साबित हुआ है, जिससे हाल ही में एफडीए अनुमोदन प्राप्त हुआ है। नैदानिक परीक्षणों में प्रारंभिक सफलता के बावजूद, कार्ट सेल थेरेपी के साथ उपचार के परिणामस्वरूप विषाक्तता होती है जो अक्सर गंभीर और कभी-कभी घातक होती है। कार्ट सेल थेरेपी के बाद सबसे आम विषाक्तता में सीआरएस और एनआई का विकास शामिल है, जिसे प्रतिरक्षा प्रभावक सेल से जुड़े न्यूरोटॉक्सिसिटी सिंड्रोम (आईसीएएनएस) 8,9 के रूप में भी जाना जाता है। सीआरएस विवो में सीएआरटी कोशिकाओं के अतिसक्रियण और बड़े पैमाने पर विस्तार के कारण होता है, जिससे इंटरफेरॉन-γ, ट्यूमर नेक्रोसिस फैक्टर-α, ग्रैनुलोसाइट-मैक्रोफेज कॉलोनी-उत्तेजक कारक (जीएम-सीएसएफ), और इंटरल्यूकिन -6 (आईएल -6) सहित कई भड़काऊ साइटोकिन्स का स्राव होता है। इसके परिणामस्वरूप हाइपोटेंशन, उच्च बुखार, केशिका रिसाव सिंड्रोम, श्वसन विफलता, बहु-अंग विफलता, और कुछ मामलों में, मृत्यु10,11 होती है। सीआरएस कार्ट 19 सेल थेरेपी 11,12,13 के बाद 50-100% मामलों में विकसित होता है। ICANS कार्ट सेल थेरेपी से जुड़ी एक और अनूठी प्रतिकूल घटना है और इसे सामान्यीकृत सेरेब्रल एडिमा, भ्रम, भ्रम, अफसिया, मोटर कमजोरी और कभी-कभी, दौरे 9,14 की विशेषता है। ICANS का कोई भी ग्रेड 70% रोगियों में होता है, और ग्रेड 3-4 20-30% रोगियों में 5,10,15,16 में रिपोर्ट किए जाते हैं। कुल मिलाकर, सीआरएस और आईसीएएनएस आम हैं और घातक हो सकते हैं।
कार्ट सेल थेरेपी के बाद ICANS का प्रबंधन चुनौतीपूर्ण है। ICANS वाले अधिकांश रोगी भी सीआरएस17 का अनुभव करते हैं, जिसे अक्सर IL-6 रिसेप्टर विरोधी टोसिलिज़ुमाब या स्टेरॉयड18 के साथ इलाज किया जा सकता है। एक पिछली रिपोर्ट से पता चला है कि टोसिलिज़ुमाब के साथ शुरुआती हस्तक्षेप ने गंभीर सीआरएस की दर को कम कर दिया लेकिन आईसीएएनएस19 की घटनाओं या गंभीरता को प्रभावित नहीं किया। वर्तमान में, ICANSs के लिए कोई प्रभावी उपचार या रोगनिरोधी एजेंट नहीं है, और निवारक रणनीतियोंकी जांच करना महत्वपूर्ण है।
माइलॉयड कोशिकाओं और संबंधित साइटोकिन्स / केमोकाइन ्स को सीआरएस और आईसीएएनएस21 के विकास के मुख्य चालक माना जाता है। जबकि सीआरएस सीधे साइटोकिन्स और टी सेल विस्तार की चरम ऊंचाई से संबंधित है, आईसीएएनएस का पैथोफिज़ियोलॉजी काफी हदतक अज्ञात है। इसलिए, एक माउस मॉडल स्थापित करना अनिवार्य है जो तंत्र का अध्ययन करने और निवारक रणनीतियों को विकसित करने के लिए कार्ट सेल थेरेपी के बाद इन विषाक्तताओं को पुन: उत्पन्न करता है।
वर्तमान में सीएआरटी कोशिकाओं की प्रभावकारिता का अध्ययन, अनुकूलन और सत्यापन करने के साथ-साथ उनके संबंधित विषाक्तताओं की निगरानी के लिए कई प्रीक्लिनिकल पशु मॉडल हैं। इनमें प्राइमेट मॉडल के अलावा सिंजेनिक, जेनोग्राफ्ट, इम्यूनोकॉम्पिटेंट ट्रांसजेनिक, मानवकृत ट्रांसजेनिक और रोगी-व्युत्पन्न जेनोग्राफ्ट चूहे शामिल हैं। हालांकि, इनमें से प्रत्येक मॉडल में कमियां हैं, और कुछ सीएआरटी कोशिकाओं24,25 की वास्तविक प्रभावकारिता या सुरक्षा चिंताओं को प्रतिबिंबित नहीं करते हैं। इसलिए, अध्ययन के इच्छित लक्ष्यों के लिए सबसे अच्छा मॉडल ध्यान से चुनना अनिवार्य है।
यह लेख उस पद्धति का वर्णन करना चाहता है जिसका उपयोग सीएआरटी सेल से जुड़े विषाक्तताओं, सीआरएस और एनआई का आकलन करने के लिए किया जाता है, जो विवो मॉडल (चित्रा 1) में सभी रोगी-व्युत्पन्न जेनोग्राफ्ट (पीडीएक्स) का उपयोग करता है। विशेष रूप से, यहां वर्णित विधियों में, लेखकों की प्रयोगशाला में उत्पन्न सीएआरटी 19 कोशिकाओं का उपयोग पहले वर्णित प्रोटोकॉल का पालन करके किया जाता है। संक्षेप में, मानव टी कोशिकाओं को घनत्व ढाल तकनीक के माध्यम से स्वस्थ दाता परिधीय रक्त मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं (पीबीएमसी) से अलग किया जाता है, जो दिन 0 पर सीडी 3 / सीडी 28 मोतियों के साथ उत्तेजित होता है, और पहले दिन सीडी 19-लक्षित एकल श्रृंखला चर टुकड़े से बने सीएआर के साथ लेंटिवायरल रूप से ट्रांसड्यूस किया जाता है। इन कार्ट कोशिकाओं को तब विस्तारित किया जाता है, 6 वें दिन डी-बीड किया जाता है, और 8 वें दिन 26,27,28,29,30 पर क्रायोसंरक्षित किया जाता है। जैसा कि पहले उल्लिखित है, चूहों को लिम्फोडेसिंग उपचार के अधीन किया जाता है, इसके बाद रोगी-व्युत्पन्न ल्यूकेमिक ब्लास्ट (एएलएल)28 का प्रशासन होता है। सबसे पहले, ट्यूमर एन्ग्राफमेंट को सबमैंडिबुलर रक्त संग्रह के माध्यम से सत्यापित किया जाता है। एक उपयुक्त ट्यूमर बोझ की स्थापना के बाद, सीएआरटी 19 कोशिकाओं को चूहों को प्रशासित किया जाता है। फिर, कल्याण का आकलन करने के लिए चूहों को दैनिक रूप से तौला जाता है। टी सेल विस्तार और साइटोकिन / केमोकाइन उत्पादन का आकलन करने के लिए पूंछ के रक्तस्राव के साथ एनआई का आकलन करने के लिए छोटे पशु चुंबकीय अनुनाद इमेजिंग (एमआरआई) का प्रदर्शन किया जाता है। नीचे वर्णित तकनीकों को पीडीएक्स मॉडल में कार्ट सेल से जुड़े विषाक्त पदार्थों का अध्ययन करने के लिए एक मॉडल के रूप में उपयोग करने की अत्यधिक अनुशंसा की जाती है।
Protocol
Representative Results
Discussion
इस रिपोर्ट में, ऑल पीडीएक्स मॉडल का उपयोग करके कार्ट सेल से जुड़े विषाक्त पदार्थों का आकलन करने के लिए एक पद्धति का वर्णन किया गया है। अधिक विशेष रूप से, यह मॉडल दो जीवन-धमकाने वाले विषाक्तताओं, सीआरएस औ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम को आंशिक रूप से राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (R37CA266344, 1K99CA273304), रक्षा विभाग (CA201127), मेयो क्लिनिक K2R पाइपलाइन (S.S.K.), मेयो क्लिनिक सेंटर फॉर इंडिविजुअलाइज्ड मेडिसिन (S.S.K.), और Predolin Foundation (R.L.S.) के माध्यम से समर्थित किया गया था। इसके अलावा, हम मेयो क्लिनिक एनएमआर कोर सुविधा कर्मचारियों को धन्यवाद देना चाहते हैं। चित्र 1 BioRender.com में बनाया गया था
Materials
| APC Anti-Human CD19 | Biolegend | 302211 | |
| Alcohol Prep Pad | Wecol | 6818 | |
| Analyze 14.0 software | AnalyzeDirect Inc. | N/A | https://analyzedirect.com/analyze14/ |
| Artificial tears (Mineral oil and petrolatum) | Akorn | 17478-062-35 | Topical ophtalmic gel to prevent eye dryness |
| BD FACS Lysing Solution | BD | 349202 | Red blood cells lysing buffer |
| BD Micro-Fin IV insulin syringes | BD | 329461 | |
| Brillian Violet 421 Anti-Human CD45 | Biolegend | 304032 | |
| Bruker Avance II 7 Tesla | Bruker Biospin | N/A | MRI machine |
| Busulfan (NSC-750) | Selleckchem | S1692 | |
| CountBright absolute counting beads | Invitrogen | C36950 | |
| CytoFLEX System B4-R2-V2 | Beckman Coulter | C10343 | flow cytometer |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline | Gibco | 14190-144 | |
| ERT Control/Gating Module | SA Instruments | Model 1030 | Small Animal Monitoring Respiratory and Gating System |
| Fetal bovine serum | Millipore Sigma | F8067 | |
| Hemocytometer | Bright-Line | Z359629-1EA | |
| Human AB Serum; Male Donors; type AB; US | Corning | 35-060-CI | |
| Isoflurane (Liquid) | Sigma-Aldrich | 792632 | |
| LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit, for 405 nm excitation | Invitrogen | L34966 | |
| Microvette 500 Lithium heparin | Sarstedt | 20.1345.100 | Blood collection tube |
| MILLIPLEX Huma/Cytokine/Chemokine Magnetic Beads Panel | Millipore Sigma | HCYTMAG-60K-PX38 | Immunology Multiplex Assay to identify cytokines and chemokines |
| Omniscan | Ge Healthcare Inc. | 0407-0690-10 | Gadolinium-based constrast agent |
| Pd Anti-Mouse CD45 | Biolegend | 103106 | |
| Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100x), Liquid | Gibco | 10378-016 | |
| Round Bottom Polysterene Test tube | Corning | 352008 | |
| Sodium Azide, 5% (w/v) | Ricca Chemical | 7144.8-16 | |
| Stainless Steel Surgical Blade | Bard-Parker | 371215 | |
| X-VIVO 15 Serum-free Hematopoietic Cell Medium | Lonza | 04-418Q |
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