Vurdering av kimær antigenreseptor T-celleassosiert toksisitet ved bruk av en akutt lymfoblastisk leukemi pasientavledet xenograftmusemodell

Summary

Her beskriver vi en protokoll der en akutt lymfoblastisk leukemi pasientavledet xenograftmodell brukes som en strategi for å vurdere og overvåke CD19-målrettet kimær antigenreseptor T-celleassosiert toksisitet.

Abstract

Chimeric antigen receptor T (CART) celleterapi har dukket opp som et kraftig verktøy for behandling av flere typer CD19 ⁺ maligniteter, noe som har ført til den nylige FDA-godkjenningen av flere CD19-målrettede CART (CART19) celleterapier. Imidlertid er CART-celleterapi forbundet med et unikt sett med toksisiteter som bærer sin egen sykelighet og dødelighet. Dette inkluderer cytokin frigjøringssyndrom (CRS) og nevroinflammasjon (NI). Bruk av prekliniske musemodeller har vært avgjørende i forskning og utvikling av CART-teknologi for å vurdere både CART-effekt og CART-toksisitet. De tilgjengelige prekliniske modellene for å teste denne adoptive cellulære immunterapien inkluderer syngene, xenograft, transgene og humaniserte musemodeller. Det er ingen enkelt modell som sømløst speiler det menneskelige immunforsvaret, og hver modell har styrker og svakheter. Dette metodepapiret tar sikte på å beskrive en pasientavledet xenograftmodell ved bruk av leukemiske blaster fra pasienter med akutt lymfoblastisk leukemi som en strategi for å vurdere CART19-assosiert toksisitet, CRS og NI. Denne modellen har vist seg å rekapitulere CART19-assosierte toksisiteter samt terapeutisk effekt som sett i klinikken.

Introduction

Kimær antigenreseptor T (CART) celleterapi har revolusjonert feltet kreftimmunterapi. Det har vist seg å være vellykket i behandling av residiverende / ildfast akutt lymfoblastisk leukemi (ALL), stor B-celle lymfom, mantelcellelymfom, follikulært lymfom og multippelt myelom 1,2,3,4,5,6,7^, noe som fører til nylige FDA-godkjenninger. Til tross for den første suksessen i kliniske studier, resulterer behandling med CART-celleterapi i toksisitet som ofte er alvorlig og noen ganger dødelig. De vanligste toksisitetene etter CART-cellebehandling inkluderer utvikling av CRS og NI, også referert til som immuneffektorcelleassosiert nevrotoksisitetssyndrom (ICANS)^8,9. CRS skyldes overaktivering og massiv ekspansjon av CART-celler in vivo, noe som fører til påfølgende sekresjon av flere inflammatoriske cytokiner, inkludert interferon-γ, tumornekrosefaktor-α, granulocytt-makrofagkolonistimulerende faktor (GM-CSF) og interleukin-6 (IL-6). Dette resulterer i hypotensjon, høy feber, kapillærlekkasjesyndrom, respirasjonssvikt, multiorgansvikt, og i noen tilfeller død^10,11. CRS utvikler seg i 50-100% av tilfellene etter CART19-celleterapi^11,12,13. ICANS er en annen unik bivirkning assosiert med CART-celleterapi og er preget av generalisert cerebralt ødem, forvirring, obtundasjon, afasi, motorisk svakhet og noen ganger anfall ^9,14. Enhver grad av ICANS forekommer hos opptil 70% av pasientene, og grad 3-4 er rapportert hos 20-30% av pasientene 5,10,15,16. Samlet sett er CRS og ICANS vanlige og kan være dødelige.

Håndteringen av ICANS etter CART-cellebehandling er utfordrende. De fleste pasienter med ICANS opplever også CRS¹⁷, som ofte kan behandles med IL-6-reseptorantagonisten tocilizumab eller steroider¹⁸. En tidligere rapport viste at tidlig intervensjon med tocilizumab reduserte forekomsten av alvorlig CRS, men ikke påvirket forekomsten eller alvorlighetsgraden av ICANS¹⁹. For tiden finnes det ingen effektiv behandling eller profylaktisk middel for ICANS, og det er avgjørende å undersøke forebyggende strategier²⁰.

Myeloide celler og tilhørende cytokiner/kjemokiner antas å være de viktigste driverne for utviklingen av CRS og ICANS²¹. Mens CRS er direkte relatert til ekstrem forhøyning av cytokiner og T-celleutvidelse, er patofysiologien til ICANS stort sett ukjent^22,23. Derfor er det viktig å etablere en musemodell som rekapitulerer disse toksisitetene etter CART-celleterapi for å studere mekanismene og utvikle forebyggende strategier.

Det er flere prekliniske dyremodeller som for tiden brukes til å studere, optimalisere og validere effekten av CART-celler, samt å overvåke deres tilknyttede toksisitet. Disse inkluderer syngene, xenograft, immunkompetente transgene, humaniserte transgene og pasientavledede xenograftmus, i tillegg til primatmodeller. Imidlertid har hver av disse modellene ulemper, og noen gjenspeiler ikke de sanne effekt- eller sikkerhetsproblemene til CART-celler^24,25. Derfor er det viktig å nøye velge den beste modellen for de tiltenkte målene for studien.

Denne artikkelen søker å beskrive metodikken som brukes for å vurdere CART-celleassosiert toksisitet, CRS og NI, ved hjelp av en ALL-pasientderivert xenograft (PDX) in vivo-modell (figur 1). Spesielt i metodene beskrevet her, brukes CART19-celler generert i forfatterens laboratorium etter tidligere beskrevne protokoller. Kort fortalt isoleres humane T-celler fra friske mononukleære celler fra perifert donorblod (PBMC) via en tetthetsgradientteknikk, stimulert med CD3/CD28-perler på dag 0, og lentiviralt transdusert på dag 1 med CAR-er sammensatt av et CD19-målrettet enkeltkjedet variabelfragment smeltet sammen med 4-1BB- og CD3ζ-signaleringsdomener. Disse CART-cellene blir deretter utvidet, de-beaded på dag 6, og kryopreservert på dag 8 26,27,28,29,30. Som skissert tidligere, blir mus utsatt for lymfodepletingbehandling, etterfulgt av administrering av pasientavledede leukemiske blaster (ALL)²⁸. Først verifiseres tumortransplantasjon via submandibulær blodsamling. Etter etablering av en passende tumorbelastning administreres CART19-celler til musene. Deretter veies musene daglig for å vurdere trivsel. Magnetisk resonanstomografi (MR) av små dyr utføres for å vurdere NI, sammen med haleblødning for å vurdere T-celleutvidelse og cytokin / kjemokinproduksjon. Teknikkene beskrevet nedenfor anbefales sterkt å brukes som en modell for å studere CART-celleassosierte toksisiteter i en PDX-modell.

Protocol

Denne protokollen følger retningslinjene til Mayo Clinic’s Institutional Review Board (IRB), Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC A00001767) og Institutional Biosafety Committee (IBC, Bios00000006.04). MERK: Alle materialer som brukes til å jobbe med mus må være sterile. 1. Injeksjon av busulfan til NSG-mus Oppnå mannlige, 8-12 uker gamle, immunkompromitterte, NOD-SCID IL2rγnull (NSG) mus, og vei dem før injeksjon….

Representative Results

Målet med denne protokollen er å vurdere CART-celleassosiert toksisitet ved hjelp av en PDX-musmodell fra tumorceller hos pasienter med ALL (figur 1). Først fikk NSG-mus i.p. injeksjoner av busulfan (30 mg/kg) med mål om å immunundertrykke dem og legge til rette for CART-celleinngrep28. Dagen etter fikk de ~5 × 106 PBMCs (i.v.) fra ALLE pasienter. Musene ble overvåket for engraftment i ~ 13 uker via haleblødningsanalysen. Røde blodlegemer …

Discussion

I denne rapporten er det beskrevet en metodikk for å vurdere CART-celleassosierte toksisiteter ved bruk av en ALL PDX-modell. Mer spesifikt søker denne modellen å etterligne to livstruende toksisiteter, CRS og NI, som pasienter ofte opplever etter infusjon av CART-celler. Det rekapitulerer mange kjennetegn ved CART toksisitet observert i klinikken: vekttap, motorisk dysfunksjon, nevroinflammasjon, inflammatorisk cytokin og kjemokinproduksjon, og infiltrasjon av forskjellige effektorceller i sen…

Materials

APC Anti-Human CD19	Biolegend	302211
Alcohol Prep Pad	Wecol	6818
Analyze 14.0 software	AnalyzeDirect Inc.	N/A	https://analyzedirect.com/analyze14/
Artificial tears (Mineral oil and petrolatum)	Akorn	17478-062-35	Topical ophtalmic gel to prevent eye dryness
BD FACS Lysing Solution	BD	349202	Red blood cells lysing buffer
BD Micro-Fin IV insulin syringes	BD	329461
Brillian Violet 421 Anti-Human CD45	Biolegend	304032
Bruker Avance II 7 Tesla	Bruker Biospin	N/A	MRI machine
Busulfan (NSC-750)	Selleckchem	S1692
CountBright absolute counting beads	Invitrogen	C36950
CytoFLEX System B4-R2-V2	Beckman Coulter	C10343	flow cytometer
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline	Gibco	14190-144
ERT Control/Gating Module	SA Instruments	Model 1030	Small Animal Monitoring Respiratory and Gating System
Fetal bovine serum	Millipore Sigma	F8067
Hemocytometer	Bright-Line	Z359629-1EA
Human AB Serum; Male Donors; type AB; US	Corning	35-060-CI
Isoflurane (Liquid)	Sigma-Aldrich	792632
LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit, for 405 nm excitation	Invitrogen	L34966
Microvette 500 Lithium heparin	Sarstedt	20.1345.100	Blood collection tube
MILLIPLEX Huma/Cytokine/Chemokine Magnetic Beads Panel	Millipore Sigma	HCYTMAG-60K-PX38	Immunology Multiplex Assay to identify cytokines and chemokines
Omniscan	Ge Healthcare Inc.	0407-0690-10	Gadolinium-based constrast agent
Pd Anti-Mouse CD45	Biolegend	103106
Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100x), Liquid	Gibco	10378-016
Round Bottom Polysterene Test tube	Corning	352008
Sodium Azide, 5% (w/v)	Ricca Chemical	7144.8-16
Stainless Steel Surgical Blade	Bard-Parker	371215
X-VIVO 15 Serum-free Hematopoietic Cell Medium	Lonza	04-418Q