בדיקת משיכה בשילוב עם ביטוי משותף בתאי חיידקים ככלי חסכוני בזמן לבדיקת אינטראקציות חלבון-חלבון מאתגרות
Summary
כאן, אנו מתארים שיטה לביטוי משותף חיידקי של חלבונים מתויגים באופן דיפרנציאלי באמצעות קבוצה של וקטורים תואמים, ואחריה טכניקות משיכה קונבנציונליות לחקר קומפלקסים חלבוניים שאינם יכולים להרכיב במבחנה.
Abstract
Pulldown הוא מבחן אינטראקציה חלבון-חלבון קל ובשימוש נרחב. עם זאת, יש לו מגבלות בחקר מתחמי חלבון שאינם מתאספים ביעילות במבחנה. קומפלקסים כאלה עשויים לדרוש הרכבה משותפת ונוכחות של מלווים מולקולריים; או שהם יוצרים אוליגומרים יציבים שאינם יכולים להתנתק ולהתחבר מחדש במבחנה , או שהם לא יציבים ללא שותף מחייב. כדי להתגבר על בעיות אלה, ניתן להשתמש בשיטה המבוססת על ביטוי משותף חיידקי של חלבונים מתויגים באופן דיפרנציאלי באמצעות קבוצה של וקטורים תואמים ואחריו טכניקות משיכה קונבנציונליות. זרימת העבודה חסכונית יותר בזמן בהשוואה למשיכה מסורתית מכיוון שהיא חסרה את השלבים הגוזלים זמן של טיהור נפרד של חלבונים המקיימים אינטראקציה והדגירה הבאה שלהם. יתרון נוסף הוא יכולת רבייה גבוהה יותר בשל מספר שלבים קטן משמעותית ופרק זמן קצר יותר שבו חלבונים הקיימים בסביבת מבחנה נחשפים לפראונוליזה ולחמצון. השיטה יושמה בהצלחה לחקר מספר אינטראקציות חלבון-חלבון כאשר טכניקות אחרות במבחנה נמצאו בלתי מתאימות. השיטה יכולה לשמש לבדיקת אינטראקציות חלבון-חלבון אצווה. תוצאות מייצגות מוצגות עבור מחקרים על אינטראקציות בין תחום BTB וחלבונים בעלי הפרעה פנימית, ועל הטרודימרים של תחומים הקשורים לאצבעות אבץ.
Introduction
משיכה קונבנציונלית נמצאת בשימוש נרחב לחקר אינטראקציות חלבון-חלבון1. עם זאת, חלבונים מטוהרים לעתים קרובות אינם מתקשרים ביעילות במבחנה2,3, וחלקם אינם מסיסים ללא שותפו הקושר 4,5. חלבונים כאלה עשויים לדרוש הרכבה משותפת או נוכחות של מלווים מולקולריים 5,6,7,8,9. מגבלה נוספת של משיכה קונבנציונלית היא בדיקת פעילות הטרומולטימריזציה אפשרית בין תחומים שיכולים להתקיים כהומו-אוליגומרים יציבים המורכבים בתרגום משותף 8,10, מכיוון שרבים מהם אינם יכולים להתנתק ולהתחבר מחדש במבחנה בזמן הדגירה. ביטוי משותף נמצא כיעיל בהתגברות על בעיות כאלה 3,11. ביטוי משותף באמצעות וקטורים תואמים בחיידקים שימש בהצלחה לטיהור קומפלקסים מקרומולקולריים מרובי יחידות גדולות, כולל קומפלקס דיכוי פוליקומב PRC212, RNA פולימראז II מתווך ראש מודול13, בקטריופאג T4 baseplate 14, SAGA קומפלקס deubiquitinylase מודול 15,16, ו ferritin 17. מקורות השכפול הנפוצים לביטוי משותף הם ColE1, p15A18, CloDF1319 ו-RSF20. במערכת הביטוי Duet הזמינה מסחרית, מקורות אלה משולבים עם גנים שונים של עמידות לאנטיביוטיקה ואתרי שיבוט מרובים נוחים ליצירת וקטורים פוליציסטרוניים, המאפשרים ביטוי של עד שמונה חלבונים. למקורות אלה יש מספרי העתקה שונים וניתן להשתמש בהם בשילובים שונים כדי להשיג רמות ביטוי מאוזנות של חלבוני מטרה21. כדי לבדוק אינטראקציות חלבון-חלבון, נעשה שימוש בתגי זיקה שונים; הנפוצים ביותר הם 6xHistidine, גלוטתיון-S-transferase (GST) וחלבון קושר מלטוז (MBP), שלכל אחד מהם זיקה ספציפית לשרף המתאים. GST ו- MBP גם משפרים את המסיסות והיציבות של חלבונים מתויגים22.
כמו כן פותחו מספר שיטות לביטוי משותף של חלבונים בתאים איקריוטים, הבולטת שבהן היא בדיקת שמרים דו-היברידית (Y2H)23. בדיקת Y2H זולה, קלה ומאפשרת בדיקה של אינטראקציות מרובות; עם זאת, זרימת העבודה שלו נמשכת יותר משבוע אחד. יש גם כמה בדיקות מבוססות תאי יונקים פחות נפוצות, לדוגמה, בדיקה פלואורסצנטית דו-היברידית (F2H)24 ובדיקת אינטראקציה חלבון-חלבון במערך התא (CAPPIA)25. בדיקת F2H מהירה יחסית, ומאפשרת לצפות באינטראקציות חלבונים בסביבה התאית הטבעית שלהם, אך כרוכה בשימוש בציוד הדמיה יקר. לכל השיטות הללו יש יתרון על פני ביטוי פרוקריוטי המספק את סביבת התרגום והקיפול האיקריוטית הילידית; עם זאת, הם מזהים אינטראקציה בעקיפין, או על ידי הפעלת שעתוק או על ידי העברת אנרגיה פלואורסצנטית, אשר לעתים קרובות מייצרת חפצים. כמו כן, תאים אאוקריוטים עשויים להכיל שותפים אחרים לאינטראקציה של חלבונים בעלי עניין, אשר יכולים להפריע לבדיקת אינטראקציות בינאריות בין חלבונים של איקריוטים גבוהים יותר.
המחקר הנוכחי מתאר שיטה לביטוי משותף חיידקי של חלבונים מתויגים באופן דיפרנציאלי ואחריו טכניקות משיכה קונבנציונליות. השיטה מאפשרת לחקור אינטראקציות בין חלבוני מטרה הדורשות ביטוי משותף. הוא חסכוני יותר בזמן בהשוואה למשיכה מסורתית, ומאפשר בדיקת אצווה של מטרות מרובות, מה שהופך אותו ליתרון ברוב המקרים. ביטוי משותף באמצעות וקטורים תואמים נוח יותר מאשר ביטוי משותף פוליציסטרוני מכיוון שהוא אינו דורש שלב שיבוט מייגע.
Protocol
Representative Results
Discussion
השיטה המתוארת מאפשרת בדיקה של אינטראקציות חלבון-חלבון שאינן ניתנות להרכבה יעילה במבחנה ודורשות ביטוי משותף. השיטה היא אחת הגישות המתאימות הבודדות לחקר חלבונים הטרודימריים, שגם הם מסוגלים להומודימריזציה, שכן כאשר הם מטוהרים בנפרד, חלבונים כאלה יוצרים הומודימרים יציבים שלרוב אינם יכ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי הקרן הרוסית למדע פרויקטים 19-74-30026 (פיתוח שיטה ותיקוף) ו 19-74-10099 (בדיקות אינטראקציה חלבון-חלבון); ועל ידי משרד המדע וההשכלה הגבוהה של הפדרציה הרוסית-מענק 075-15-2019-1661 (ניתוח של אינטראקציות חלבון-חלבון מייצג).
Materials
| 8-ELEMENT probe | Sonics | 630-0586 | The high throughput 8-element sonicator probes |
| Agar | AppliChem | A0949 | |
| Amylose resin | New England Biolabs | E8021 | Resin for purification of MBP-tagged proteins |
| Antibiotics | AppliChem | A4789 (kanamycin); A0839 (ampicillin) | |
| Beta-mercaptoethanol | AppliChem | A1108 | |
| BL21(DE3) | Novagen | 69450-M | |
| CaCl2 | AppliChem | A4689 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5415R (Z605212) | |
| Glutathione | AppliChem | A9782 | |
| Glutathione agarose | Pierce | 16100 | Resin for purification of GST-tagged proteins |
| Glycerol | AppliChem | A2926 | |
| HEPES | AppliChem | A3724 | |
| HisPur Ni-NTA Superflow Agarose | Thermo Scientific | 25214 | Resin for purification of 6xHis-tagged proteins |
| Imidazole | AppliChem | A1378 | |
| IPTG | AppliChem | A4773 | |
| KCl | AppliChem | A2939 | |
| LB | AppliChem | 414753 | |
| Maltose | AppliChem | A3891 | |
| MOPS | AppliChem | A2947 | |
| NaCl | AppliChem | A2942 | |
| NP40 | Roche | 11754599001 | |
| pACYCDuet-1 | Sigma-Aldrich | 71147 | Vector for co-expression of proteins with p15A replication origin |
| pCDFDuet-1 | Sigma-Aldrich | 71340 | Vector for co-expression of proteins with CloDF13 replication origin |
| PMSF | AppliChem | A0999 | |
| Protease Inhibitor Cocktail VII | Calbiochem | 539138 | Protease Inhibitor Cocktail |
| pRSFDuet-1 | Sigma-Aldrich | 71341 | Vector for co-expression of proteins with RSF replication origin |
| SDS | AppliChem | A2263 | |
| Tris | AppliChem | A2264 | |
| VC505 sonicator | Sonics | CV334 | Ultrasonic liquid processor |
| ZnCl2 | AppliChem | A6285 |
References
- Louche, A., Salcedo, S. P., Bigot, S. Protein-protein interactions: Pulldown assays. Methods in Molecular Biology. 1615, 247-255 (2017).
- Rose, R. B., et al. Structural basis of dimerization, coactivator recognition and MODY3 mutations in HNF-1alpha. Nature Structural & Molecular Biology. 7 (9), 744-748 (2000).
- Bonchuk, A., et al. Structural basis of diversity and homodimerization specificity of zinc-finger-associated domains in Drosophila. Nucleic Acids Research. 49 (4), 2375-2389 (2021).
- Nair, S. K., Burley, S. K. X-ray structures of Myc-Max and Mad-Max recognizing DNA. Molecular bases of regulation by proto-oncogenic transcription factors. Cell. 112 (2), 193-205 (2003).
- Badonyi, M., Marsh, J. A. Large protein complex interfaces have evolved to promote co-translational assembly. Elife. 11, 79602 (2022).
- Kramer, G., Shiber, A., Bukau, B. Mechanisms of cotranslational maturation of newly synthesized proteins. Annual Reviews in Biochemistry. 88, 337-364 (2019).
- Koubek, J., Schmitt, J., Galmozzi, C. V., Kramer, G. Mechanisms of cotranslational protein maturation in bacteria. Frontiers in Molecular Biosciences. 8, 689755 (2021).
- Shiber, A., et al. Cotranslational assembly of protein complexes in eukaryotes revealed by ribosome profiling. Nature. 561 (7722), 268-272 (2018).
- Shieh, Y. W., et al. Operon structure and co-translational subunit association direct protein assembly in bacteria. Science. 350 (6261), 678-680 (2015).
- Bertolini, M., et al. Interactions between nascent proteins translated by adjacent ribosomes drive homomer assembly. Science. 371 (6524), 57-64 (2021).
- Bonchuk, A. N., et al. Structural insights into highly similar spatial organization of zinc-finger associated domains with a very low sequence similarity. Structure. 30 (7), 1004-1015 (2022).
- Justin, N., et al. Structural basis of oncogenic histone H3K27M inhibition of human polycomb repressive complex 2. Nature Communications. 7, 11316 (2016).
- Lariviere, L., et al. Structure of the mediator head module. Nature. 492 (7429), 448-451 (2012).
- Taylor, N. M., et al. Structure of the T4 baseplate and its function in triggering sheath contraction. Nature. 533 (7603), 346-352 (2016).
- Samara, N. L., et al. Structural insights into the assembly and function of the SAGA deubiquitinating module. Science. 328 (5981), 1025-1029 (2010).
- Kohler, A., Zimmerman, E., Schneider, M., Hurt, E., Zheng, N. Structural basis for assembly and activation of the heterotetrameric SAGA histone H2B deubiquitinase module. Cell. 141 (4), 606-617 (2010).
- Rucker, P., Torti, F. M., Torti, S. V. Recombinant ferritin: modulation of subunit stoichiometry in bacterial expression systems. Protein Engineering. 10 (8), 967-973 (1997).
- Selzer, G., Som, T., Itoh, T., Tomizawa, J. The origin of replication of plasmid p15A and comparative studies on the nucleotide sequences around the origin of related plasmids. Cell. 32 (1), 119-129 (1983).
- Nijkamp, H. J., et al. The complete nucleotide sequence of the bacteriocinogenic plasmid CloDF13. Plasmid. 16 (2), 135-160 (1986).
- Som, T., Tomizawa, J. Origin of replication of Escherichia coli plasmid RSF 1030. Molecular General Genetics. 187 (3), 375-383 (1982).
- Tsao, K. L., Waugh, D. S. Balancing the production of two recombinant proteins in Escherichia coli by manipulating plasmid copy number: high-level expression of heterodimeric Ras farnesyltransferase. Protein Expression Purification. 11 (3), 233-240 (1997).
- Nallamsetty, S., Waugh, D. S. Solubility-enhancing proteins MBP and NusA play a passive role in the folding of their fusion partners. Protein Expression Purification. 45 (1), 175-182 (2006).
- Paiano, A., Margiotta, A., De Luca, M., Bucci, C. Yeast two-hybrid assay to identify interacting proteins. Current Protocols in Protein Science. 95 (1), 70 (2019).
- Zolghadr, K., Rothbauer, U., Leonhardt, H. The fluorescent two-hybrid (F2H) assay for direct analysis of protein-protein interactions in living cells. Methods in Molecular Biology. 812, 275-282 (2012).
- Fiebitz, A., et al. High-throughput mammalian two-hybrid screening for protein-protein interactions using transfected cell arrays. BMC Genomics. 9, 68 (2008).
- Bonchuk, A. N., Georgiev, P. G., Maksimenko, O. G. CTCF and Sgfl1 proteins form alternative complexes with ENY2 proteins. Doklady Biochemistry and Biophysics. 468 (1), 180-182 (2016).
- Maksimenko, O., et al. Two new insulator proteins, Pita and ZIPIC, target CP190 to chromatin. Genome Research. 25 (1), 89-99 (2015).
- Sabirov, M., et al. Mechanism and functional role of the interaction between CP190 and the architectural protein Pita in Drosophila melanogaster. Epigenetics Chromatin. 14 (1), 16 (2021).
- Dong, S., Provart, N. J. Analyses of protein interaction networks using computational tools. Methods in Molecular Biology. 1794, 97-117 (2018).
