Pulldown Testi, Zorlu Protein-Protein Etkileşimlerini Test Etmek İçin Zaman Verimli Bir Araç Olarak Bakteri Hücrelerinde Ko-Ekspresyon ile Birleştiğinde
Summary
Burada, bir dizi uyumlu vektör kullanarak diferansiyel olarak etiketlenmiş proteinlerin bakteriyel birlikte ekspresyonu için bir yöntem açıklıyoruz, ardından in vitro olarak bir araya gelemeyen protein komplekslerini incelemek için geleneksel pulldown teknikleri izleniyor.
Abstract
Pulldown, kolay ve yaygın olarak kullanılan bir protein-protein etkileşim testidir. Bununla birlikte, in vitro olarak etkili bir şekilde bir araya gelmeyen protein komplekslerini incelemede sınırlamaları vardır. Bu tür kompleksler, ko-translasyonel montaj ve moleküler şaperonların varlığını gerektirebilir; ya in vitro olarak ayrışamayan ve yeniden birleşemeyen kararlı oligomerler oluştururlar ya da bağlayıcı bir partner olmadan kararsızdırlar. Bu sorunların üstesinden gelmek için, geleneksel pulldown tekniklerinin izlediği bir dizi uyumlu vektör kullanarak farklı şekilde etiketlenmiş proteinlerin bakteriyel birlikte ekspresyonuna dayanan bir yöntem kullanmak mümkündür. İş akışı, geleneksel pulldown’a kıyasla daha zaman verimlidir, çünkü etkileşime giren proteinlerin ayrı ayrı saflaştırılması ve sonraki inkübasyonlarının zaman alıcı adımlarından yoksundur. Diğer bir avantaj, önemli ölçüde daha az sayıda adım ve in vitro ortamda bulunan proteinlerin proteoliz ve oksidasyona maruz kaldığı daha kısa bir süre nedeniyle daha yüksek bir tekrarlanabilirliktir. Yöntem, diğer in vitro tekniklerin uygun olmadığı tespit edildiğinde bir dizi protein-protein etkileşimini incelemek için başarıyla uygulandı. Yöntem, protein-protein etkileşimlerini toplu olarak test etmek için kullanılabilir. BTB alanı ile içsel olarak düzensiz proteinler arasındaki etkileşimlerin ve çinko-parmak ile ilişkili alanların heterodimerlerinin çalışmaları için temsili sonuçlar gösterilmiştir.
Introduction
Geleneksel pulldown, protein-protein etkileşimlerini incelemek için yaygın olarak kullanılır1. Bununla birlikte, saflaştırılmış proteinler genellikle in vitro2,3 etkili bir şekilde etkileşime girmez ve bazılarıbağlanma ortakları 4,5 olmadan çözünmez. Bu tür proteinler ko-translasyonel montaj veya moleküler şaperonların varlığı gerektirebilir 5,6,7,8,9. Konvansiyonel pulldown’un bir başka sınırlaması, 8,10 ile birlikte translasyonelolarak bir araya getirilmiş kararlı homo-oligomerler olarak var olabilen alanlar arasındaki olası heteromultimerizasyon aktivitesinin test edilmesidir, çünkü birçoğu kuluçka süresi boyunca in vitro olarak ayrışamaz ve yeniden ilişkilendirilemez. Bu tür sorunların üstesinden gelmede birlikte ifade etmenin yararlı olduğu bulunmuştur 3,11. Bakterilerde uyumlu vektörler kullanılarak birlikte ekspresyon, polikomb baskılayıcı kompleks PRC2 12, RNA polimeraz II mediatör kafa modülü 13, bakteriyofaj T4 taban plakası14, SAGA kompleksi deubikitinilaz modülü 15,16 ve ferritin 17’yi içeren büyük çok alt birimli makromoleküler kompleksleri saflaştırmak için başarıyla kullanılmıştır. Birlikte ifade için yaygın olarak kullanılan çoğaltma kaynakları ColE1, p15A18, CloDF1319 ve RSF20’dir. Ticari olarak temin edilebilen Duet ekspresyon sisteminde, bu kökenler farklı antibiyotik direnç genleri ve polisitronik vektörler üretmek için uygun çoklu klonlama bölgeleri ile birleştirilir ve sekiz proteine kadar ekspresyona izin verir. Bu kökenler farklı kopya numaralarına sahiptir ve hedef proteinlerin dengeli ekspresyon seviyelerini elde etmek için çeşitli kombinasyonlarda kullanılabilir21. Protein-protein etkileşimlerini test etmek için çeşitli afinite etiketleri kullanılır; en yaygın olanları 6xHistidin, glutatyon-S-transferaz (GST) ve maltoz bağlayıcı proteindir (MBP), bunların her biri karşılık gelen reçineye spesifik bir afiniteye sahiptir. GST ve MBP ayrıca etiketli proteinlerin çözünürlüğünü ve kararlılığını arttırır22.
Ökaryotik hücrelerde protein ko-ekspresyonunu içeren bir dizi yöntem de geliştirilmiştir, bunlardan en önemlisi maya iki hibrid tahlilidir (Y2H)23. Y2H testi ucuz, kolaydır ve çoklu etkileşimlerin test edilmesine izin verir; ancak, iş akışının tamamlanması 1 haftadan fazla sürer. Ayrıca, daha az sıklıkla kullanılan birkaç memeli hücre bazlı tahlil vardır, örneğin, floresan iki hibrid tahlil (F2H)24 ve hücre dizisi protein-protein etkileşim testi (CAPPIA)25. F2H testi nispeten hızlıdır ve doğal hücresel ortamlarında protein etkileşimlerini gözlemlemeye izin verir, ancak pahalı görüntüleme ekipmanlarının kullanılmasını içerir. Tüm bu yöntemler, doğal ökaryotik çeviri ve katlama ortamı sağlayan prokaryotik ifadeye göre avantajlıdır; Bununla birlikte, etkileşimi dolaylı olarak, transkripsiyonel aktivasyon veya genellikle eserler üreten floresan enerji transferi yoluyla tespit ederler. Ayrıca, ökaryotik hücreler, daha yüksek ökaryotların proteinleri arasındaki ikili etkileşimlerin test edilmesine müdahale edebilen, ilgilenilen proteinlerin diğer etkileşim ortaklarını içerebilir.
Bu çalışma, diferansiyel olarak etiketlenmiş proteinlerin bakteriyel birlikte ekspresyonu için bir yöntemi ve ardından geleneksel pulldown tekniklerini açıklamaktadır. Yöntem, birlikte ekspresyon gerektiren hedef proteinler arasındaki etkileşimlerin incelenmesine izin verir. Geleneksel pulldown’a kıyasla daha zaman verimlidir ve birden fazla hedefin toplu olarak test edilmesine izin verir, bu da çoğu durumda avantajlı olmasını sağlar. Uyumlu vektörler kullanılarak birlikte ifade, zahmetli bir klonlama adımı gerektirmediğinden polisitronik birlikte ifadeden daha uygundur.
Protocol
Representative Results
Discussion
Tarif edilen yöntem, in vitro olarak verimli bir şekilde monte edilemeyen ve birlikte ekspresyon gerektiren protein-protein etkileşimlerinin test edilmesine izin verir. Bu yöntem, homodimerizasyon yeteneğine sahip heterodimerize edici proteinleri incelemek için birkaç uygun yaklaşımdan biridir, çünkü ayrı ayrı saflaştırıldığında, bu tür proteinler deney sırasında çoğu zaman ayrışamayan ve yeniden birleşemeyen kararlı homodimerler oluşturur 3,11<sup…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma, Rus Bilim Vakfı’nın 19-74-30026 (yöntem geliştirme ve doğrulama) ve 19-74-10099 (protein-protein etkileşim tahlilleri) projeleri tarafından desteklenmiştir; ve Rusya Federasyonu Bilim ve Yüksek Öğretim Bakanlığı tarafından 075-15-2019-1661 (temsili protein-protein etkileşimlerinin analizi) hibesi.
Materials
| 8-ELEMENT probe | Sonics | 630-0586 | The high throughput 8-element sonicator probes |
| Agar | AppliChem | A0949 | |
| Amylose resin | New England Biolabs | E8021 | Resin for purification of MBP-tagged proteins |
| Antibiotics | AppliChem | A4789 (kanamycin); A0839 (ampicillin) | |
| Beta-mercaptoethanol | AppliChem | A1108 | |
| BL21(DE3) | Novagen | 69450-M | |
| CaCl2 | AppliChem | A4689 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5415R (Z605212) | |
| Glutathione | AppliChem | A9782 | |
| Glutathione agarose | Pierce | 16100 | Resin for purification of GST-tagged proteins |
| Glycerol | AppliChem | A2926 | |
| HEPES | AppliChem | A3724 | |
| HisPur Ni-NTA Superflow Agarose | Thermo Scientific | 25214 | Resin for purification of 6xHis-tagged proteins |
| Imidazole | AppliChem | A1378 | |
| IPTG | AppliChem | A4773 | |
| KCl | AppliChem | A2939 | |
| LB | AppliChem | 414753 | |
| Maltose | AppliChem | A3891 | |
| MOPS | AppliChem | A2947 | |
| NaCl | AppliChem | A2942 | |
| NP40 | Roche | 11754599001 | |
| pACYCDuet-1 | Sigma-Aldrich | 71147 | Vector for co-expression of proteins with p15A replication origin |
| pCDFDuet-1 | Sigma-Aldrich | 71340 | Vector for co-expression of proteins with CloDF13 replication origin |
| PMSF | AppliChem | A0999 | |
| Protease Inhibitor Cocktail VII | Calbiochem | 539138 | Protease Inhibitor Cocktail |
| pRSFDuet-1 | Sigma-Aldrich | 71341 | Vector for co-expression of proteins with RSF replication origin |
| SDS | AppliChem | A2263 | |
| Tris | AppliChem | A2264 | |
| VC505 sonicator | Sonics | CV334 | Ultrasonic liquid processor |
| ZnCl2 | AppliChem | A6285 |
References
- Louche, A., Salcedo, S. P., Bigot, S. Protein-protein interactions: Pulldown assays. Methods in Molecular Biology. 1615, 247-255 (2017).
- Rose, R. B., et al. Structural basis of dimerization, coactivator recognition and MODY3 mutations in HNF-1alpha. Nature Structural & Molecular Biology. 7 (9), 744-748 (2000).
- Bonchuk, A., et al. Structural basis of diversity and homodimerization specificity of zinc-finger-associated domains in Drosophila. Nucleic Acids Research. 49 (4), 2375-2389 (2021).
- Nair, S. K., Burley, S. K. X-ray structures of Myc-Max and Mad-Max recognizing DNA. Molecular bases of regulation by proto-oncogenic transcription factors. Cell. 112 (2), 193-205 (2003).
- Badonyi, M., Marsh, J. A. Large protein complex interfaces have evolved to promote co-translational assembly. Elife. 11, 79602 (2022).
- Kramer, G., Shiber, A., Bukau, B. Mechanisms of cotranslational maturation of newly synthesized proteins. Annual Reviews in Biochemistry. 88, 337-364 (2019).
- Koubek, J., Schmitt, J., Galmozzi, C. V., Kramer, G. Mechanisms of cotranslational protein maturation in bacteria. Frontiers in Molecular Biosciences. 8, 689755 (2021).
- Shiber, A., et al. Cotranslational assembly of protein complexes in eukaryotes revealed by ribosome profiling. Nature. 561 (7722), 268-272 (2018).
- Shieh, Y. W., et al. Operon structure and co-translational subunit association direct protein assembly in bacteria. Science. 350 (6261), 678-680 (2015).
- Bertolini, M., et al. Interactions between nascent proteins translated by adjacent ribosomes drive homomer assembly. Science. 371 (6524), 57-64 (2021).
- Bonchuk, A. N., et al. Structural insights into highly similar spatial organization of zinc-finger associated domains with a very low sequence similarity. Structure. 30 (7), 1004-1015 (2022).
- Justin, N., et al. Structural basis of oncogenic histone H3K27M inhibition of human polycomb repressive complex 2. Nature Communications. 7, 11316 (2016).
- Lariviere, L., et al. Structure of the mediator head module. Nature. 492 (7429), 448-451 (2012).
- Taylor, N. M., et al. Structure of the T4 baseplate and its function in triggering sheath contraction. Nature. 533 (7603), 346-352 (2016).
- Samara, N. L., et al. Structural insights into the assembly and function of the SAGA deubiquitinating module. Science. 328 (5981), 1025-1029 (2010).
- Kohler, A., Zimmerman, E., Schneider, M., Hurt, E., Zheng, N. Structural basis for assembly and activation of the heterotetrameric SAGA histone H2B deubiquitinase module. Cell. 141 (4), 606-617 (2010).
- Rucker, P., Torti, F. M., Torti, S. V. Recombinant ferritin: modulation of subunit stoichiometry in bacterial expression systems. Protein Engineering. 10 (8), 967-973 (1997).
- Selzer, G., Som, T., Itoh, T., Tomizawa, J. The origin of replication of plasmid p15A and comparative studies on the nucleotide sequences around the origin of related plasmids. Cell. 32 (1), 119-129 (1983).
- Nijkamp, H. J., et al. The complete nucleotide sequence of the bacteriocinogenic plasmid CloDF13. Plasmid. 16 (2), 135-160 (1986).
- Som, T., Tomizawa, J. Origin of replication of Escherichia coli plasmid RSF 1030. Molecular General Genetics. 187 (3), 375-383 (1982).
- Tsao, K. L., Waugh, D. S. Balancing the production of two recombinant proteins in Escherichia coli by manipulating plasmid copy number: high-level expression of heterodimeric Ras farnesyltransferase. Protein Expression Purification. 11 (3), 233-240 (1997).
- Nallamsetty, S., Waugh, D. S. Solubility-enhancing proteins MBP and NusA play a passive role in the folding of their fusion partners. Protein Expression Purification. 45 (1), 175-182 (2006).
- Paiano, A., Margiotta, A., De Luca, M., Bucci, C. Yeast two-hybrid assay to identify interacting proteins. Current Protocols in Protein Science. 95 (1), 70 (2019).
- Zolghadr, K., Rothbauer, U., Leonhardt, H. The fluorescent two-hybrid (F2H) assay for direct analysis of protein-protein interactions in living cells. Methods in Molecular Biology. 812, 275-282 (2012).
- Fiebitz, A., et al. High-throughput mammalian two-hybrid screening for protein-protein interactions using transfected cell arrays. BMC Genomics. 9, 68 (2008).
- Bonchuk, A. N., Georgiev, P. G., Maksimenko, O. G. CTCF and Sgfl1 proteins form alternative complexes with ENY2 proteins. Doklady Biochemistry and Biophysics. 468 (1), 180-182 (2016).
- Maksimenko, O., et al. Two new insulator proteins, Pita and ZIPIC, target CP190 to chromatin. Genome Research. 25 (1), 89-99 (2015).
- Sabirov, M., et al. Mechanism and functional role of the interaction between CP190 and the architectural protein Pita in Drosophila melanogaster. Epigenetics Chromatin. 14 (1), 16 (2021).
- Dong, S., Provart, N. J. Analyses of protein interaction networks using computational tools. Methods in Molecular Biology. 1794, 97-117 (2018).
