Saggio di pulldown accoppiato con co-espressione in cellule batteriche come strumento efficiente in termini di tempo per testare interazioni proteina-proteina impegnative
Summary
Qui, descriviamo un metodo per la co-espressione batterica di proteine marcate differenzialmente utilizzando un insieme di vettori compatibili, seguito dalle tecniche convenzionali di pulldown per studiare complessi proteici che non possono assemblarsi in vitro.
Abstract
Il pulldown è un test di interazione proteina-proteina facile e ampiamente utilizzato. Tuttavia, ha limitazioni nello studio di complessi proteici che non si assemblano efficacemente in vitro. Tali complessi possono richiedere l’assemblaggio co-traduzionale e la presenza di chaperoni molecolari; o formano oligomeri stabili che non possono dissociarsi e riassociarsi in vitro o sono instabili senza un partner legante. Per superare questi problemi, è possibile utilizzare un metodo basato sulla co-espressione batterica di proteine marcate differenzialmente utilizzando un insieme di vettori compatibili seguiti dalle tecniche convenzionali di pulldown. Il flusso di lavoro è più efficiente in termini di tempo rispetto al pulldown tradizionale perché manca delle lunghe fasi di purificazione separata delle proteine interagenti e della loro successiva incubazione. Un altro vantaggio è una maggiore riproducibilità dovuta a un numero significativamente inferiore di passaggi e un periodo di tempo più breve in cui le proteine che esistono all’interno dell’ambiente in vitro sono esposte alla proteolisi e all’ossidazione. Il metodo è stato applicato con successo per studiare una serie di interazioni proteina-proteina quando altre tecniche in vitro sono risultate inadatte. Il metodo può essere utilizzato per testare in batch le interazioni proteina-proteina. Risultati rappresentativi sono mostrati per studi di interazioni tra dominio BTB e proteine intrinsecamente disordinate, e di eterodimeri di domini associati a dita di zinco.
Introduction
Il pulldown convenzionale è ampiamente utilizzato per studiare le interazioni proteina-proteina1. Tuttavia, le proteine purificate spesso non interagiscono efficacemente in vitro2,3, e alcune di esse sono insolubili senza il loro partner legante 4,5. Tali proteine potrebbero richiedere l’assemblaggio co-traduzionale o la presenza di chaperoni molecolari 5,6,7,8,9. Un’altra limitazione del pulldown convenzionale è la verifica della possibile attività di eteromultimerizzazione tra domini che possono esistere come omo-oligomeri stabili assemblati co-traduzionalmente 8,10, poiché molti di essi non possono dissociarsi e riassociarsi in vitro durante il tempo di incubazione. La co-espressione è risultata utile per superare tali problemi 3,11. La co-espressione utilizzando vettori compatibili nei batteri è stata utilizzata con successo per purificare grandi complessi macromolecolari multi-subunità, incluso il complesso repressivo policomb PRC212, il modulo testa del mediatore della RNA polimerasi II13, il batteriofago T4 baseplate 14, il modulo di deubiquitinylasi del complesso SAGA 15,16 e la ferritina 17. Le origini di replica comunemente usate per la co-espressione sono ColE1, p15A18, CloDF1319 e RSF20. Nel sistema di espressione Duet disponibile in commercio, queste origini sono combinate con diversi geni di resistenza agli antibiotici e convenienti siti di clonazione multipli per produrre vettori policistroni, consentendo l’espressione di un massimo di otto proteine. Queste origini hanno numeri di copie diversi e possono essere utilizzate in varie combinazioni per raggiungere livelli di espressione equilibrati delle proteine bersaglio21. Per testare le interazioni proteina-proteina, vengono utilizzati vari tag di affinità; i più comuni sono la 6xIstidina, la glutatione-S-transferasi (GST) e la proteina legante il maltosio (MBP), ognuno dei quali ha un’affinità specifica con la resina corrispondente. GST e MBP migliorano anche la solubilità e la stabilità delle proteine marcate22.
Sono stati inoltre sviluppati numerosi metodi che coinvolgono la co-espressione proteica nelle cellule eucariotiche, il più importante dei quali è il saggio a due ibridi di lievito (Y2H)23. Il test Y2H è economico, facile e consente di testare più interazioni; Tuttavia, il completamento del flusso di lavoro richiede più di 1 settimana. Esistono anche alcuni saggi basati su cellule di mammifero meno frequentemente utilizzati, ad esempio il saggio fluorescente a due ibridi (F2H)24 e il saggio di interazione proteina-proteina (CAPPIA)25. Il test F2H è relativamente veloce, consentendo di osservare le interazioni proteiche nel loro ambiente cellulare nativo, ma comporta l’uso di costose apparecchiature di imaging. Tutti questi metodi hanno un vantaggio rispetto all’espressione procariotica che fornisce la traduzione eucariotica nativa e l’ambiente di piegatura; Tuttavia, rilevano l’interazione indirettamente, sia per attivazione trascrizionale che per trasferimento di energia fluorescente, che spesso produce artefatti. Inoltre, le cellule eucariotiche possono contenere altri partner di interazione di proteine di interesse, che possono interferire con il test delle interazioni binarie tra proteine di eucarioti superiori.
Il presente studio descrive un metodo per la co-espressione batterica di proteine marcate in modo differenziale seguito da tecniche convenzionali di pulldown. Il metodo consente di studiare le interazioni tra proteine bersaglio che richiedono co-espressione. È più efficiente in termini di tempo rispetto al pulldown tradizionale, consentendo il test in batch di più obiettivi, il che lo rende vantaggioso nella maggior parte dei casi. La co-espressione usando vettori compatibili è più conveniente della co-espressione policistronica poiché non richiede una laboriosa fase di clonazione.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il metodo descritto consente di testare le interazioni proteina-proteina che non possono essere assemblate in modo efficiente in vitro e richiedono la co-espressione. Il metodo è uno dei pochi approcci adatti per lo studio delle proteine eterodimerizzanti, che sono anche in grado di omodimerizzare poiché, se purificate separatamente, tali proteine formano omodimeri stabili che il più delle volte non possono dissociarsi e riassociarsi durante l’esperimento 3,11<sup class="xre…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto dai progetti della Russian Science Foundation 19-74-30026 (sviluppo e convalida del metodo) e 19-74-10099 (saggi di interazione proteina-proteina); e dal Ministero della Scienza e dell’Istruzione Superiore della Federazione Russa-grant 075-15-2019-1661 (analisi delle interazioni rappresentative proteina-proteina).
Materials
| 8-ELEMENT probe | Sonics | 630-0586 | The high throughput 8-element sonicator probes |
| Agar | AppliChem | A0949 | |
| Amylose resin | New England Biolabs | E8021 | Resin for purification of MBP-tagged proteins |
| Antibiotics | AppliChem | A4789 (kanamycin); A0839 (ampicillin) | |
| Beta-mercaptoethanol | AppliChem | A1108 | |
| BL21(DE3) | Novagen | 69450-M | |
| CaCl2 | AppliChem | A4689 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5415R (Z605212) | |
| Glutathione | AppliChem | A9782 | |
| Glutathione agarose | Pierce | 16100 | Resin for purification of GST-tagged proteins |
| Glycerol | AppliChem | A2926 | |
| HEPES | AppliChem | A3724 | |
| HisPur Ni-NTA Superflow Agarose | Thermo Scientific | 25214 | Resin for purification of 6xHis-tagged proteins |
| Imidazole | AppliChem | A1378 | |
| IPTG | AppliChem | A4773 | |
| KCl | AppliChem | A2939 | |
| LB | AppliChem | 414753 | |
| Maltose | AppliChem | A3891 | |
| MOPS | AppliChem | A2947 | |
| NaCl | AppliChem | A2942 | |
| NP40 | Roche | 11754599001 | |
| pACYCDuet-1 | Sigma-Aldrich | 71147 | Vector for co-expression of proteins with p15A replication origin |
| pCDFDuet-1 | Sigma-Aldrich | 71340 | Vector for co-expression of proteins with CloDF13 replication origin |
| PMSF | AppliChem | A0999 | |
| Protease Inhibitor Cocktail VII | Calbiochem | 539138 | Protease Inhibitor Cocktail |
| pRSFDuet-1 | Sigma-Aldrich | 71341 | Vector for co-expression of proteins with RSF replication origin |
| SDS | AppliChem | A2263 | |
| Tris | AppliChem | A2264 | |
| VC505 sonicator | Sonics | CV334 | Ultrasonic liquid processor |
| ZnCl2 | AppliChem | A6285 |
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