Nedtrekksanalyse kombinert med co-uttrykk i bakterieceller som et tidseffektivt verktøy for å teste utfordrende protein-protein-interaksjoner

Summary

Her beskriver vi en metode for bakteriell samekspresjon av differensielt merkede proteiner ved hjelp av et sett med kompatible vektorer, etterfulgt av konvensjonelle nedtrekksteknikker for å studere proteinkomplekser som ikke kan samles in vitro.

Abstract

Nedtrekk er en enkel og mye brukt protein-protein-interaksjonsanalyse. Det har imidlertid begrensninger i å studere proteinkomplekser som ikke monteres effektivt in vitro. Slike komplekser kan kreve co-translasjonell montering og tilstedeværelsen av molekylære chaperoner; Enten danner de stabile oligomerer som ikke kan dissosiere og assosieres in vitro , eller de er ustabile uten en bindende partner. For å overvinne disse problemene er det mulig å bruke en metode basert på bakteriell samuttrykk av differensielt merkede proteiner ved hjelp av et sett med kompatible vektorer etterfulgt av konvensjonelle nedtrekksteknikker. Arbeidsflyten er mer tidseffektiv sammenlignet med tradisjonell nedtrekk fordi den mangler de tidkrevende trinnene med separat rensing av samvirkende proteiner og deres påfølgende inkubasjon. En annen fordel er en høyere reproduserbarhet på grunn av et betydelig mindre antall trinn og en kortere periode hvor proteiner som finnes i in vitro-miljøet blir utsatt for proteolyse og oksidasjon. Metoden ble vellykket brukt for å studere en rekke protein-protein-interaksjoner når andre in vitro-teknikker ble funnet å være uegnet. Metoden kan brukes til batchtesting av protein-protein-interaksjoner. Representative resultater er vist for studier av interaksjoner mellom BTB-domene og iboende forstyrrede proteiner, og av heterodimerer av sink-finger-assosierte domener.

Introduction

Konvensjonell nedtrekk er mye brukt til å studere protein-protein-interaksjoner¹. Imidlertid interagerer rensede proteiner ofte ikke effektivt in vitro^2,3, og noen av dem er uløselige uten bindingspartner ^4,5. Slike proteiner kan kreve co-translasjonell montering eller tilstedeværelse av molekylære chaperones 5,6,7,8,9. En annen begrensning av konvensjonell nedtrekk er testing av mulig heteromultimeriseringsaktivitet mellom domener som kan eksistere som stabile homo-oligomerer samlet co-translasjonelt ^8,10, da mange av dem ikke kan dissosiere og re-assosiere in vitro i inkubasjonstiden. Meduttrykk ble funnet å være nyttig for å overvinne slike problemer ^3,11. Samuttrykk ved bruk av kompatible vektorer i bakterier ble vellykket brukt til å rense store multi-subenhet makromolekylære komplekser, inkludert polycomb repressive komplekse PRC2¹², RNA polymerase II mediatorhodemodul¹³, bakteriofag T4 baseplate 14, SAGA-kompleks deubiquitinylasemodul 15,16 og ferritin ¹⁷. Replikasjonsopprinnelser som vanligvis brukes for co-uttrykk er ColE1, p15A¹⁸, CloDF13¹⁹ og RSF²⁰. I det kommersielt tilgjengelige Duet-ekspresjonssystemet kombineres disse opprinnelsene med forskjellige antibiotikaresistensgener og praktiske flere kloningssteder for å produsere polycistronic vektorer, noe som tillater ekspresjon av opptil åtte proteiner. Disse opprinnelsene har forskjellige kopinumre og kan brukes i varierende kombinasjoner for å oppnå balanserte ekspresjonsnivåer av målproteiner²¹. For å teste protein-protein-interaksjoner brukes forskjellige affinitetsmerker; de vanligste er 6xHistidin, glutation-S-transferase (GST) og maltosebindende protein (MBP), som hver har en spesifikk affinitet til den tilsvarende harpiksen. GST og MBP forbedrer også løseligheten og stabiliteten til merkede proteiner²².

En rekke metoder som involverer proteinekspresjon i eukaryote celler har også blitt utviklet, hvorav den mest fremtredende er gjær-to-hybridanalyse (Y2H)²³. Y2H-analysen er billig, enkel og tillater testing av flere interaksjoner; Imidlertid tar arbeidsflyten mer enn 1 uke å fullføre. Det er også noen få mindre brukte pattedyrcellebaserte analyser, for eksempel fluorescerende to-hybridanalyse (F2H)²⁴ og cellematriseprotein-proteininteraksjonsanalyse (CAPPIA)²⁵. F2H-analysen er relativt rask, noe som gjør det mulig å observere proteininteraksjoner i sitt opprinnelige cellulære miljø, men innebærer bruk av dyrt bildeutstyr. Alle disse metodene har en fordel i forhold til prokaryot uttrykk som gir det opprinnelige eukaryote oversettelses- og foldemiljøet; Imidlertid oppdager de interaksjon indirekte, enten ved transkripsjonsaktivering eller ved fluorescerende energioverføring, som ofte produserer artefakter. Eukaryote celler kan også inneholde andre interaksjonspartnere av proteiner av interesse, noe som kan forstyrre testingen av binære interaksjoner mellom proteiner av høyere eukaryoter.

Denne studien beskriver en metode for bakteriell samekspresjon av differensielt merkede proteiner etterfulgt av konvensjonelle nedtrekksteknikker. Metoden tillater å studere interaksjoner mellom målproteiner som krever samuttrykk. Det er mer tidseffektivt sammenlignet med tradisjonell nedtrekk, noe som tillater batchtesting av flere mål, noe som gjør det fordelaktig i de fleste tilfeller. Samuttrykk ved hjelp av kompatible vektorer er mer praktisk enn polycistronic co-uttrykk siden det ikke krever et møysommelig kloningstrinn.

Protocol

Den skjematiske fremstillingen av arbeidsflyten for metoden er vist i figur 1. 1. Samtransformasjon av E. coli Klargjøre ekspresjonsvektorer for målproteiner ved bruk av standard kloningsmetoder.MERK: Vanligvis er et godt utgangspunkt å bruke konvensjonelle pGEX / pMAL-vektorer som bærer et ampicillinresistensgen og ColE1-opprinnelse for ekspresjon av GST / MBP-merkede proteiner og en kompatibel vektor med p15A- eller RS…

Representative Results

Den beskrevne metoden ble brukt rutinemessig med mange forskjellige mål. Her presenteres noen representative resultater som sannsynligvis ikke kan oppnås ved hjelp av konvensjonelle nedtrekksteknikker. Den første er studiet av spesifikk ZAD (Zinc-finger-associated domain) dimerisering11. ZAD danner stabile og spesifikke dimerer, med heterodimerer som bare er mulig mellom nært beslektede domener innenfor paraloge grupper. Dimerene dannet av disse domenene er stabile og dissocierer ikke i minst …

Discussion

Den beskrevne metoden tillater testing av protein-protein-interaksjoner som ikke effektivt kan settes sammen in vitro og krever samuttrykk. Metoden er en av de få egnede tilnærmingene for å studere heterodimeriserende proteiner, som også er i stand til homodimerisering, siden slike proteiner danner stabile homodimerer når de renses separat som oftest ikke kan dissosiere og knytte seg sammen igjen under forsøket ^3,11.

Arb…

Materials

8-ELEMENT probe	Sonics	630-0586	The high throughput 8-element sonicator probes
Agar	AppliChem	A0949
Amylose resin	New England Biolabs	E8021	Resin for purification of MBP-tagged proteins
Antibiotics	AppliChem	A4789 (kanamycin); A0839 (ampicillin)
Beta-mercaptoethanol	AppliChem	A1108
BL21(DE3)	Novagen	69450-M
CaCl2	AppliChem	A4689
Centrifuge	Eppendorf	5415R (Z605212)
Glutathione	AppliChem	A9782
Glutathione agarose	Pierce	16100	Resin for purification of GST-tagged proteins
Glycerol	AppliChem	A2926
HEPES	AppliChem	A3724
HisPur Ni-NTA Superflow Agarose	Thermo Scientific	25214	Resin for purification of 6xHis-tagged proteins
Imidazole	AppliChem	A1378
IPTG	AppliChem	A4773
KCl	AppliChem	A2939
LB	AppliChem	414753
Maltose	AppliChem	A3891
MOPS	AppliChem	A2947
NaCl	AppliChem	A2942
NP40	Roche	11754599001
pACYCDuet-1	Sigma-Aldrich	71147	Vector for co-expression of proteins with p15A replication origin
pCDFDuet-1	Sigma-Aldrich	71340	Vector for co-expression of proteins with CloDF13 replication origin
PMSF	AppliChem	A0999
Protease Inhibitor Cocktail VII	Calbiochem	539138	Protease Inhibitor Cocktail
pRSFDuet-1	Sigma-Aldrich	71341	Vector for co-expression of proteins with RSF replication origin
SDS	AppliChem	A2263
Tris	AppliChem	A2264
VC505 sonicator	Sonics	CV334	Ultrasonic liquid processor
ZnCl2	AppliChem	A6285