Bepaling van de paringsefficiëntie van haploïden in Saccharomyces cerevisiae

Summary

In dit werk wordt een robuuste methode beschreven voor de kwantificering van de paringsefficiëntie in de gist Saccharomyces cerevisiae . Deze methode is met name nuttig voor de kwantificering van pre-zygote barrières in soortvormingsstudies.

Abstract

Saccharomyces cerevisiae is een veelgebruikt modelorganisme in de genetica, evolutie en moleculaire biologie. In de afgelopen jaren is het ook een populair modelorganisme geworden om problemen met betrekking tot soortvorming te bestuderen. De levenscyclus van gist omvat zowel aseksuele als seksuele voortplantingsfasen. Het gemak van het uitvoeren van evolutie-experimenten en de korte generatietijd van het organisme maken de studie van de evolutie van voortplantingsbarrières mogelijk. De efficiëntie waarmee de twee paringstypen (a en α) paren om de a/α diploïde te vormen, wordt de paringsefficiëntie genoemd. Elke afname van de paringsefficiëntie tussen haploïden duidt op een pre-zygote barrière. Om de mate van reproductieve isolatie tussen twee haploïden te kwantificeren, is dus een robuuste methode nodig om de paringsefficiëntie te kwantificeren. Hiertoe wordt hier een eenvoudig en zeer reproduceerbaar protocol gepresenteerd. Het protocol omvat vier hoofdstappen, waaronder het patchen van de haploïden op een YPD-plaat, het mengen van de haploïden in gelijke aantallen, verdunnen en plateren voor afzonderlijke kolonies en ten slotte het berekenen van de efficiëntie op basis van het aantal kolonies op een drop-out plaat. Auxotrofe markers worden gebruikt om duidelijk het onderscheid te maken tussen haploïden en diploïden.

Introduction

Saccharomyces cerevisiae, gewoonlijk ontluikende gist genoemd, is een eencellige eukaryoot. Het heeft twee paringstypen, een en α, en vertoont zowel aseksuele als seksuele voortplantingscycli. De a– en α-paringstypen zijn haploïden en kunnen mitoïde delen in afwezigheid van het andere paringstype in de omgeving, dat de aseksuele cyclus van gist vertegenwoordigt. Wanneer de twee paringstypen dicht bij elkaar zijn, stoppen ze mitotisch met delen en fuseren ze tot een diploïde cel. De diploïde gist kan zich mitotisch delen wanneer voedingsstoffen aanwezig zijn of meiose ondergaan onder de omstandigheden van stikstofgebrek in de aanwezigheid van een slechte koolstofbron die niet-fermenteerbaar is, zoals acetaat¹. Dit resulteert in de vorming van sporen, die slapend blijven totdat er gunstige groeiomstandigheden zijn. De levenscyclus is voltooid wanneer deze sporen ontkiemen en de twee haploïde typen weer worden vrijgegeven aan de haploïde pool ^2,3 (figuur 1).

De paring van gistcellen omvat verschillende stappen, zoals agglutinatie, de vorming van een paringsprojectie of “shmoo”, gevolgd door cel- en kernfusie ^4,5. De twee paringstypen a en α produceren respectievelijk a-factor en α-factor om de paring te initiëren. Deze factoren zijn polypeptideferomonen die binden aan de receptoren (Ste2 en Ste3) die aanwezig zijn op het celoppervlak van het tegenovergestelde paringstype⁵. De binding van de feromonen aan de receptoren initieert de feromoonresponsroute, de mitogeen-geactiveerde proteïnekinase (MAPK) signaaltransductieroute ^6,7,8. Dit resulteert in het stoppen van de celcyclus in de G1-fase, wat leidt tot een metabolisch actieve stationaire fase⁹. De cellen stoppen dan met mitotisch delen en de eiwitten die nodig zijn voor de paring worden gesynthetiseerd. Omdat de haploïde cellen niet naar elkaar toe kunnen bewegen, wordt een paringsprojectie of “shmoo” gericht op de paringspartner. Wanneer de cellen in contact komen, wordt de celwand afgebroken en fuseert de cytoplasmatische inhoud, wat resulteert in paring om een diploïde cel te vormen^10,11. De paringsefficiëntie tussen haploïden is gebruikt als een maat voor soortvorming in laboratorium-geëvolueerde stammen, evenals tussen bestaande soorten¹².

Omdat het een eenvoudig eukaryoot organisme is, is gist het model bij uitstek voor een groot aantal onderzoeksvragen die verband houden met complexe eukaryote organismen. Een dergelijke vraag houdt verband met soortvorming en de evolutie van voortplantingsbarrières^13,14. Voor seksueel reproducerende organismen wordt een soort gedefinieerd door het biologische soortconcept (BSC) voorgesteld door Ernst Mayr¹⁵. Volgens dit concept wordt gezegd dat twee individuen van een populatie tot twee verschillende soorten behoren als ze niet kunnen kruisen en reproductief geïsoleerd zijn. Afbraak van de seksuele voortplantingscyclus (die de fusie van gameten omvat om een zygote te vormen, de ontwikkeling van de zygote tot een nageslacht en het bereiken van seksuele volwassenheid in het nageslacht) leidt tot reproductieve isolatie. Zoals te zien is in figuur 1, is de levenscyclus van S. cerevisiae vergelijkbaar met de seksuele voortplantingscyclus: a) de fusie van de twee paringstypen a en α is vergelijkbaar met de fusie van gameten in seksueel reproducerende organismen; b) het vermogen van de diploïde om mitotische deling te ondergaan is gelijk aan de zygote die zich ontwikkelt tot nakomelingen; en c) de diploïde die sporulatie ondergaat is vergelijkbaar met het proces van gametogenese¹⁴.

Pre-zygote isolatie treedt op wanneer assortatieve paring wordt waargenomen. Gegeven een gelijke kans om te paren met twee genetisch verschillende a-types , paart een α type bij voorkeur met de ene boven de andere of omgekeerd¹⁴. In het geval van evolutie-experimenten waarbij haploïden in verschillende omgevingen zijn geëvolueerd, kan de aanwezigheid van een pre-paringsbarrière worden bepaald door een paringstest uit te voeren. Een afname van de paringsefficiëntie in vergelijking met de voorouder duidt op de evolutie van een pre-paringsbarrière. Post-zygote isolatie kan ontstaan als gevolg van het onvermogen van de diploïde om effectieve mitotische deling en/of sporulatie te ondergaan om haploïde sporen te vormen¹⁴. Deze kunnen worden gekwantificeerd door respectievelijk de groeisnelheid van de diploïden te meten en de sporulatie-efficiëntie te berekenen. Om de evolutie van voortplantingsbarrières te bestuderen, zijn daarom robuuste methoden nodig voor het kwantificeren van (a) de paringsefficiëntie, (b) de mitotische groei van de diploïde en (c) de sporulatie-efficiëntie van de diploïde. In dit werk wordt een robuuste methode gerapporteerd om de paringsefficiëntie van giststammen te kwantificeren.

In laboratoriumexperimenten is een van de manieren waarop het optreden van paring kan worden gedetecteerd, door auxotrofe markers te gebruiken die de voedingsbehoeften aanvullen. Wanneer de twee paringstypen auxotroof zijn voor twee verschillende aminozuren, kan alleen de diploïde cel gevormd door de fusie van de twee paringstypen groeien op een medium met een tekort aan beide aminozuren. Aujobtrofe markers zijn dus nuttig voor het detecteren van paring, zowel kwalitatief als kwantitatief. Een kwalitatieve test volstaat om het paringstype van een stam na meiose^{te identificeren 16}. Kwantitatieve tests zijn essentieel wanneer men geïnteresseerd is in het identificeren van een vermindering van de paring tijdens het bestuderen van de genen die betrokken zijn bij de paringsroute^17,18. Bovendien, met gist die steeds vaker wordt gebruikt in soortvormingsstudies, is een handige en reproduceerbare paringstest noodzakelijk, omdat de kwantificering van de paringsefficiëntie een maat is voor de pre-zygote barrière.

De paringsefficiëntie tussen de twee gistparingstypen is eerder gekwantificeerd^16,19,20. De meeste van de eerder gebruikte methoden zijn vergelijkbaar in hun ontwerp met een paar variaties 16,21,22,23,24,25. Sommigen van hen gebruiken vroege logfaseculturen, terwijl een paar anderen mid-logfaseculturen van haploïde stammen gebruiken. Er zijn variaties in de verhoudingen waarin de twee paringstypen worden gemengd. Bijna alle protocollen gebruiken een nitrocellulosemembraan. Suspensies van beide paringstypen uit eerder gekweekte culturen worden gemengd en gefilterd op een nitrocellulosemembraan dat op een YPD-plaat wordt geplaatst. In een van de varianten van het protocol wordt de haploïde suspensie direct gepatcht op een YPD-plaat²¹. In experimenten die zich bezighouden met de genen die betrokken zijn bij de feromoonproductie van de twee paringstypen, worden de feromonen extern toegevoegd terwijl de suspensies van de twee paringstypen²⁴ worden gemaakt.

Na incubatie gedurende een paar uur (meestal ongeveer 5 uur) na het mengen van de haploïden, worden de cellen van het membraan afgewassen, verdund en verguld op selectieve media. In een van de eerdere methoden die in 1973 werden gerapporteerd, werd de efficiëntie van zygotevorming of paring berekend door het aantal budded cells, unbudded cells en paringsparen onder een microscoop te tellen met behulp van een hemocytometer²⁶. De meeste later gerapporteerde methoden gebruiken echter auxotrofe markers om haploïden en diploïden te onderscheiden. Paringsefficiëntie wordt berekend als het percentage diploïde cellen ten opzichte van het aantal diploïde en haploïde cellen in de cellulaire pool 16,21,23.

Ondanks een aantal rapporten die gist als modelorganisme gebruiken om soortvorming te bestuderen, is er tot nu toe geen gestandaardiseerd protocol in de literatuur gerapporteerd voor het berekenen van de efficiëntie van paring. Cellen in de logfase zijn mogelijk niet ideaal voor de kwantificering van de paringsefficiëntie. Tijdens de paring wordt de celcyclus van de twee haploïden gestopt en daarom delen de cellen tijdens de paring niet⁹. Omdat ook bekend is dat de celcyclus op dezelfde manier wordt gestopt in cellen in de stationaire fase²⁷, kan het gebruik van dergelijke cellen het protocol reproduceerbaarder maken. Stationaire fasecellen kunnen worden gemengd en op YPD-platen (d.w.z. een voedingsrijke omgeving) worden gelegd om te paren. De conventionele procedures vereisen ook een nitrocellulosemembraan en het afwassen van de cellen, waardoor het proces omslachtig is en vatbaar voor verwerkingsfouten. Bovendien kwantificeren de protocollen die tot nu toe zijn gebruikt de paringsefficiëntie in termen van één haploïde. Bij het meten van reproductieve isolatie wordt de paringsefficiëntie echter gekwantificeerd voor een bepaalde combinatie van haploïden in plaats van een enkele haploïde.

Om deze problemen aan te pakken, rapporteren we hier een robuuste methode voor de kwantificering van de paringsefficiëntie in gist die zeer reproduceerbaar en gemakkelijk te gebruiken is. Bovendien kunnen deze methode en de giststammen die hier worden gebruikt ook worden gebruikt in studies die het effect van genstroom op de evolutie van paringsbarrières onderzoeken.

In deze studie werden twee verschillende stammen van S. cerevisiae gebruikt. Een van de stammen is afgeleid van de SK1-achtergrond; dit werd in ons laboratorium aangepast door toevoeging van de auxotrofe markers in de buurt van de MAT-locus. De resulterende genotypen van de haploïden zijn weergegeven in tabel 1^28,29,30. In de SK1-stam had de a haploïde het TRP1-gen ingebracht in de buurt van de MAT-locus en de α haploïde had het LEU2-gen ingebracht in de buurt van de MAT-locus. In de ScAM-stam werden de TRP1– en URA3-genen ingebracht in respectievelijk de a– en α haploïden. De plaats van insertie was in het ARS-gebied van chromosoom III (Chr III: 197378..197609). Voor het hier gerapporteerde protocol zouden auxotrofe markers overal op het genoom voldoende zijn. Het hebben van de auxotrofe markers in de buurt van de MAT-locus betekent echter dat deze stammen ook kunnen worden gebruikt voor studies die het effect van genstroom op soortvorming^31,32 onderzoeken. De markers werden dicht bij de MAT-locus toegevoegd om te voorkomen dat de markers opnieuw worden geherschikt als gevolg van recombinatie. Daarom kan dit protocol worden gebruikt om de paringsefficiëntie te kwantificeren in studies met soortvorming en ook om de verandering van paringsefficiëntie te identificeren bij het bestuderen van de eiwitten die betrokken zijn bij de paringsroute.

Protocol

OPMERKING: Het protocol omvat in grote lijnen de volgende stappen: (1) het patchen van de haploïden in de paringsefficiëntieroosters op een YPD-plaat, (2) het mengen van de haploïden in gelijke aantallen na 24 uur incubatie en het geven van de gemengde haploïden een paar uur om te paren (7 uur in deze studie), (3) het plateren van de gemengde cellen op YPD voor het isoleren van enkele kolonies na 7 uur bij 30 °C, en ten slotte (4) het bepalen van het aantal diploïden gevormd met behulp van de auxotrofe markers. De…

Representative Results

Kwantificering van de paringsefficiëntie van de twee paringstypenHet hier beschreven protocol werd gebruikt om de paringsefficiëntie tussen twee giststammen te kwantificeren – tussen SK1AM a en SK1AM α en tussen ScAMa en ScAMα (figuur 3A). In deze experimenten werd de paring tussen de twee haploïden minstens 12 keer herhaald. In elk van de herhalingen van het experiment werden minstens 100 kolonies…

Discussion

De kwantificering van de paringsefficiëntie in S. cerevisiae is essentieel voor het uitvoeren van studies met betrekking tot de genen die betrokken zijn bij paringsroutes of het bestuderen van de invloed van de externe omgeving op paringsgedrag. In de afgelopen twee decennia is S. cerevisiae ook een populair model geworden om vragen met betrekking tot soortvorming 14,36,37,38 te beantwoorden.<sup cl…

Materials

Adenine	Sigma Life Science	A8626
Agar Powder regular grade for bacteriology	SRL	19661 (0140186)
Ammonium Sulphate, Hi-AR	HiMedia	GRM1273
D-(+)-glucose	Sigma Life Science	G8270
Glass Petri plates	HiMedia	PW008	90 mm x 15 mm dimension
L-Arginine	Sigma Life Science	A8094
L-Aspartic acid	Sigma Life Science	A7219
L-Histidine monochloride monohydrate	Sigma Life Science	H5659
L-Isoleucine	Sigma Aldrich	I2752
L-Leucine	Sigma Life Science	L8912
L-Lysine	Aldrich	62840
L-Methionine	Sigma Life Science	M5308
L-Phenylalanine	Sigma Life Science	P5482
L-Threonine	Sigma Aldrich	T8625
L-Tyrosine	Sigma Life Science	T8566
L-Valine	Sigma Life Science	V0513
Mating efficiency grid			1 cm x 1.5 cm rectangular grid drawn on the Petri plate
Microcentrifuge tubes	Tarsons	500010
Peptone	HiMedia	RM001
Uracil	Sigma Life Science	U0750
Yeast Extract Powder	HiMedia	RM027
Yeast Nitrogen Base w/o Amino acids and Ammonium Sulphate	BD Difco	233520