Saccharomyces cerevisiae에서 반수체의 짝짓기 효율 측정
Summary
이 연구에서는 효모 Saccharomyces cerevisiae 의 짝짓기 효율을 정량화하는 강력한 방법이 설명되어 있습니다. 이 방법은 종 분화 연구에서 접합 전 장벽의 정량화에 특히 유용합니다.
Abstract
사카로미세스 세레비시아(Saccharomyces cerevisiae)는 유전학, 진화 및 분자 생물학에서 널리 사용되는 모델 유기체입니다. 최근 몇 년 동안, 그것은 또한 종 분화와 관련된 문제를 연구하는 인기있는 모델 유기체가되었습니다. 효모의 수명주기는 무성 생식 단계와 유성 생식 단계를 모두 포함합니다. 진화 실험을 수행하기 쉽고 유기체의 짧은 생성 시간은 생식 장벽의 진화에 대한 연구를 가능하게합니다. 두 가지 짝짓기 유형(a 및 α)이 짝을 이루어 a/α 이배체를 형성하는 효율을 짝짓기 효율이라고 합니다. 반수체 사이의 짝짓기 효율의 감소는 접합 전 장벽을 나타냅니다. 따라서, 두 반수체 사이의 생식 격리 정도를 정량화하기 위해서는 짝짓기 효율을 정량화하는 강력한 방법이 필요합니다. 이를 위해 간단하고 재현성이 높은 프로토콜이 여기에 제시됩니다. 이 프로토콜에는 YPD 플레이트에 반수체를 패치하고, 동일한 수의 반수체를 혼합하고, 단일 콜로니에 대해 희석 및 도금하고, 마지막으로 드롭아웃 플레이트의 콜로니 수를 기반으로 효율성을 계산하는 등 4가지 주요 단계가 포함됩니다. Auxotrophic 마커는 반수체와 이배체를 명확하게 구별하기 위해 사용됩니다.
Introduction
일반적으로 신진 효모라고 불리는 Saccharomyces cerevisiae는 단세포 진핵생물입니다. a와 α의 두 가지 짝짓기 유형이 있으며 무성 생식 주기와 유성 생식 주기를 모두 나타냅니다. a 및 α 짝짓기 유형은 반수체이며 주변 환경에 다른 짝짓기 유형이 없을 때 유사분열할 수 있으며, 이는 효모의 무성 주기를 나타냅니다. 두 짝짓기 유형이 가까이 있으면 유사 분열을 멈추고 융합하여 이배체 세포를 형성합니다. 이배체 효모는 영양소가 존재할 때 유사분열을 일으키거나 아세테이트1과 같이 발효되지 않는 열악한 탄소원이 있는 상태에서 질소 결핍 조건에서 감수분열을 겪을 수 있습니다. 그 결과 포자가 형성되어 유리한 성장 조건이 될 때까지 휴면 상태로 유지됩니다. 이 포자가 발아하고 두 가지 반수체 유형이 반수체 풀 2,3으로 다시 방출되면 수명주기가 완료됩니다 (그림 1).
효모 세포의 교배는 응집, 교미 돌기 또는 “shmoo”의 형성, 세포 및 핵융합 4,5와 같은 여러 단계를 포함합니다. 두 가지 결합 유형 a 와 α는 각각 a-인자와 α-인자를 생성하여 결합을 시작합니다. 이러한 인자는 반대 짝짓기 유형5의 세포 표면에 존재하는 수용체(Ste2 및 Ste3)에 결합하는 폴리펩티드 페로몬입니다. 페로몬과 수용체의 결합은 페로몬 반응 경로, 즉 미토겐 활성화 단백질 키나아제(MAPK) 신호 전달 경로 6,7,8을 개시한다. 그 결과 G1 단계에서 세포주기가 정지되어 대사 활성 정지 단계9로 이어집니다. 그런 다음 세포는 유사 분열을 멈추고 짝짓기에 필요한 단백질이 합성됩니다. 반수체 세포가 서로를 향해 움직일 수 없기 때문에 짝짓기 돌출부 또는 “shmoo”가 짝짓기 파트너를 향합니다. 세포가 접촉하게 되면, 세포벽이 분해되고, 세포질 내용물이 융합되어, 짝짓기를 하여 이배체 세포를 형성한다(10,11). 반수체 사이의 짝짓기 효율은 실험실에서 진화한 균주와 현존하는 종 사이의 종분화의 척도로 사용되어 왔다12.
단순한 진핵 생물이기 때문에 효모는 복잡한 진핵 생물과 관련된 많은 연구 질문에 대한 선택 모델입니다. 그러한 질문 중 하나는 종 분화와 생식 장벽의 진화와 관련이 있습니다13,14. 유성 생식 유기체의 경우, 종은 Ernst Mayr15가 제안한 생물학적 종 개념 (BSC)에 의해 정의됩니다. 이 개념에 따르면, 개체군의 두 개체는 교배할 수 없고 생식적으로 고립된 경우 두 개의 다른 종에 속한다고 합니다. 유성 생식주기의 붕괴 (배우자가 접합체를 형성하고, 접합체가 자손으로 발달하고, 자손의 성적 성숙에 도달하는 것을 포함)는 생식 격리로 이어진다. 그림 1에서 볼 수 있듯이 S. cerevisiae의 수명주기는 유성생식주기와 비슷합니다 : a) 두 가지 짝짓기 유형 a와 α의 융합은 유성 생식 유기체에서 배우자의 융합과 유사합니다. b) 유사분열을 겪는 이배체의 능력은 자손으로 발달하는 접합체와 동일하다. c) 포자 형성을 겪고 있는 이배체는 배우자 형성 과정과 비슷하다(14).
접합 전 분리는 구색 짝짓기가 관찰 될 때 발생합니다. 유전 적으로 다른 두 가지 유형과 짝짓기를 할 수 있는 동등한 기회가 주어진다면, α 유형은 다른 유형보다 우선적으로 짝짓기를 하거나 그 반대의 경우도 마찬가지이다14. 반수체가 상이한 환경에서 진화 된 진화 실험의 경우, 짝짓기 분석을 수행하여 사전 짝짓기 장벽의 존재를 결정할 수 있습니다. 조상과 비교할 때 짝짓기 효율의 감소는 짝짓기 전 장벽의 진화를 나타냅니다. 접합체 후 분리(post-zygotic isolation)는 이배체가 효과적인 유사분열 및/또는 포자형성을 통해 반수체 포자를 형성할 수 없기 때문에 발생할 수 있다14. 이들은 이배체의 성장 속도를 측정하고 포자 형성 효율을 각각 계산하여 정량화할 수 있습니다. 따라서 생식 장벽의 진화를 연구하기 위해서는 (a) 짝짓기 효율, (b) 이배체의 유사분열 성장 및 (c) 이배체의 포자 형성 효율을 정량화하기 위한 강력한 방법이 필요합니다. 이 연구에서, 효모 균주의 교배 효율을 정량화하는 강력한 방법이 보고되었다.
실험실 실험에서 짝짓기 발생을 감지할 수 있는 방법 중 하나는 영양 요구 사항을 보완하는 영양요구성 마커를 사용하는 것입니다. 두 가지 짝짓기 유형이 두 개의 다른 아미노산에 대해 영양요구성 인 경우, 두 가지 짝짓기 유형의 융합에 의해 형성된 이배체 세포 만이 두 아미노산이 모두 결핍 된 배지에서 성장할 수 있습니다. 따라서, 영양요구성 마커는 정성적 및 정량적으로 짝짓기를 검출하는데 유용하다. 정성적 검사는 감수 분열 후 균주의 짝짓기 유형을 확인하기에 충분할 것이다16. 정량적 검사는 짝짓기 경로17,18에 관여하는 유전자를 연구하는 동안 짝짓기 감소를 확인하는 데 관심이 있을 때 필수적입니다. 또한, 효모가 종 분화 연구에 점점 더 많이 사용됨에 따라, 짝짓기 효율의 정량화는 접합 전 장벽의 척도이기 때문에 편리하고 재현 가능한 짝짓기 분석이 필요합니다.
두 효모 교배 유형 사이의 교배 효율은 이전에 정량화되었습니다16,19,20. 이전에 사용된 대부분의 방법은 16,21,22,23,24,25와 같은 몇 가지 변형을 제외하고는 디자인이 유사합니다. 그들 중 일부는 초기 로그 단계 배양을 사용하는 반면, 다른 일부는 반수체 균주의 중간 로그 단계 배양을 사용합니다. 두 가지 결합 유형이 혼합되는 비율에는 차이가 있습니다. 거의 모든 프로토콜은 니트로셀룰로오스 막을 사용합니다. 이전에 성장한 배양물로부터 채취한 두 가지 짝짓기 유형의 현탁액을 혼합하고 YPD 플레이트 상에 놓인 니트로셀룰로스 막 상에 여과한다. 프로토콜의 변형들 중 하나에서, 반수체 현탁액은 YPD 플레이트(21) 상에 직접 패치된다. 두 가지 짝짓기 유형의 페로몬 생산에 관여하는 유전자를 다루는 실험에서, 페로몬은 두 가지 짝짓기 유형의 현탁액을 만드는 동안 외부적으로 첨가된다24.
반수체를 혼합한 후 몇 시간(일반적으로 약 5시간) 동안 배양한 후 세포를 멤브레인에서 씻어내고 희석한 다음 선택적 배지에 도말합니다. 1973년에 보고된 초기 방법 중 하나에서, 접합체 형성 또는 짝짓기의 효율은 혈구계를 사용하여 현미경으로 발아 세포, 발아 세포 및 짝짓기 쌍의 수를 계산하여 계산되었습니다26. 그러나 나중에 보고된 대부분의 방법은 반수체와 이배체를 구별하기 위해 영양요구성 마커를 사용합니다. 짝짓기 효율은 세포 풀내의 이배체 및 반수체 세포의 수에 대한 이배체 세포의 백분율로서 계산된다 16,21,23.
그러나 종분화를 연구하기 위해 효모를 모델 유기체로 사용하는 많은 보고에도 불구하고 지금까지 짝짓기 효율을 계산하기 위한 표준화된 프로토콜이 문헌에 보고되지 않았습니다. 로그 단계의 셀은 짝짓기 효율의 정량화에 이상적이지 않을 수 있습니다. 짝짓기 동안, 두 반수체의 세포주기가 정지되고, 따라서 짝짓기 중 세포는 분열하지 않는다9. 세포 주기가 또한 정지 위상27에서 세포에서 유사하게 정지되는 것으로 알려져 있기 때문에, 이러한 세포를 사용하여 프로토콜을 보다 재현가능하게 할 수 있다. 고정상 세포는 짝짓기를 위해 YPD 플레이트(즉, 영양이 풍부한 환경)에 혼합되고 배치될 수 있습니다. 또한 기존 절차에서는 니트로셀룰로오스 멤브레인을 사용하고 세포를 세척해야 하므로 프로세스가 번거롭고 처리 오류가 발생하기 쉽습니다. 또한, 현재까지 사용된 프로토콜은 하나의 반수체 측면에서 짝짓기 효율을 정량화합니다. 그러나, 생식 격리를 측정할 때, 짝짓기 효율은 단일 반수체가 아닌 반수체의 특정 조합에 대해 정량화된다.
이러한 문제를 해결하기 위해 여기에서 우리는 재현성이 높고 사용하기 쉬운 효모의 짝짓기 효율을 정량화하는 강력한 방법을 보고합니다. 또한, 이 방법과 여기에 사용된 효모 균주는 짝짓기 장벽의 진화에 대한 유전자 흐름의 영향을 조사하는 연구에도 사용할 수 있습니다.
이 연구에서는 S. cerevisiae의 두 가지 다른 균주가 사용되었습니다. 균주 중 하나는 SK1 배경에서 파생됩니다. 이것은 MAT 유전자좌 근처에 영양요구성 마커를 추가하여 실험실에서 수정되었습니다. 반수체의 생성된 유전자형은 표 128,29,30에 제공된다. SK1 균주에서, 반수체는 MAT 유전자좌 근처에 삽입된 TRP1 유전자를 가졌고, α 반수체는 MAT 유전자좌 근처에 삽입된 LEU2 유전자를 가졌다. ScAM 균주에서, TRP1 및 URA3 유전자를 각각 a 및 α 반수체에 삽입하였다. 삽입 위치는 염색체 III의 ARS 영역이었습니다(Chr III: 197378..197609). 여기에 보고된 프로토콜의 경우 게놈의 어느 곳에서나 영양요구성 마커로 충분합니다. 그러나 MAT 유전자좌 근처에 영양요구성 마커가 있다는 것은 이러한 균주가 종분화에 대한 유전자 흐름의 영향을 조사하는 연구에도 사용될 수 있음을 의미합니다31,32. 마커는 재조합으로 인한 마커의 재편성을 방지하기 위해 MAT 유전자좌 가까이에 추가되었습니다. 따라서 이 프로토콜은 종분화와 관련된 연구에서 짝짓기 효율을 정량화하고 짝짓기 경로에 관여하는 단백질을 연구할 때 짝짓기 효율의 변화를 확인하는 데 사용할 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
S. cerevisiae의 짝짓기 효율 정량화는 짝짓기 경로에 관여하는 유전자와 관련된 연구를 수행하거나 짝짓기 행동에 대한 외부 환경의 영향을 연구하는 데 필수적입니다. 지난 20년 동안 S. cerevisiae는 종분화 14,36,37,38과 관련된 질문을 해결하는 인기 있는 모델이 되었습니다. 두 가지 짝짓기 ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 DBT/Wellcome Trust(India Alliance) 보조금(IA/S/19/2/504632)으로 자금을 지원받았습니다. SPN은 DBT/Wellcome Trust(India Alliance) 보조금(IA/S/19/2/504632)의 지원을 받는 연구원입니다. A.M.은 선임 연구원 (09 / 087 (0873) / 2017-EMR-I)로서 인도 정부의 과학 및 산업 연구위원회 (CSIR)의 지원을 받고 있습니다. 저자는 토론에 대해 Paike Jayadeva Bhat에게 감사드립니다.
Materials
| Adenine | Sigma Life Science | A8626 | |
| Agar Powder regular grade for bacteriology | SRL | 19661 (0140186) | |
| Ammonium Sulphate, Hi-AR | HiMedia | GRM1273 | |
| D-(+)-glucose | Sigma Life Science | G8270 | |
| Glass Petri plates | HiMedia | PW008 | 90 mm x 15 mm dimension |
| L-Arginine | Sigma Life Science | A8094 | |
| L-Aspartic acid | Sigma Life Science | A7219 | |
| L-Histidine monochloride monohydrate | Sigma Life Science | H5659 | |
| L-Isoleucine | Sigma Aldrich | I2752 | |
| L-Leucine | Sigma Life Science | L8912 | |
| L-Lysine | Aldrich | 62840 | |
| L-Methionine | Sigma Life Science | M5308 | |
| L-Phenylalanine | Sigma Life Science | P5482 | |
| L-Threonine | Sigma Aldrich | T8625 | |
| L-Tyrosine | Sigma Life Science | T8566 | |
| L-Valine | Sigma Life Science | V0513 | |
| Mating efficiency grid | 1 cm x 1.5 cm rectangular grid drawn on the Petri plate | ||
| Microcentrifuge tubes | Tarsons | 500010 | |
| Peptone | HiMedia | RM001 | |
| Uracil | Sigma Life Science | U0750 | |
| Yeast Extract Powder | HiMedia | RM027 | |
| Yeast Nitrogen Base w/o Amino acids and Ammonium Sulphate | BD Difco | 233520 |
References
- Neiman, A. M. Sporulation in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 189 (3), 737-765 (2011).
- Duina, A. A., Miller, M. E., Keeney, J. B. Budding yeast for budding geneticists: A primer on the Saccharomyces cerevisiae model system. Genetics. 197 (1), 33-48 (2014).
- Herskowitz, I. Life cycle of the budding yeast Saccharomyces cerevisiae. Microbiological Reviews. 52 (4), 536-553 (1988).
- Erdman, S., Lin, L., Malczynski, M., Snyder, M. Pheromone-regulated genes required for yeast mating differentiation. Journal of Cell Biology. 140 (3), 461-483 (1998).
- Merlini, L., Dudin, O., Martin, S. G. Mate and fuse: How yeast cells do it. Open Biology. 3 (3), 130008 (2013).
- Gustin, M. C., Albertyn, J., Alexander, M., Davenport, K. MAP kinase pathways in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 62 (4), 1264-1300 (1998).
- Bardwell, L. A walk-through of the yeast mating pheromone response pathway. Peptides. 26 (2), 339-350 (2005).
- Reid, B. J., Hartwell, L. H. Regulation of mating in the cell cycle of Saccharomyces cerevisiae. Journal of Cell Biology. 75, 355-365 (1977).
- Williams, T. C., Peng, B., Vickers, C. E., Nielsen, L. K. The Saccharomyces cerevisiae pheromone-response is a metabolically active stationary phase for bio-production. Metabolic Engineering Communications. 3, 142-152 (2016).
- Bagnat, M., Simons, K. Cell surface polarization during yeast mating. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (22), 14183-14188 (2002).
- Trueheart, J., Boeke, J. D., Fink, G. R. Two genes required for cell fusion during yeast conjugation: Evidence for a pheromone-induced surface protein. Molecular and Cellular Biology. 7 (7), 2316-2328 (1987).
- Sniegowski, P. D., Dombrowski, P. G., Fingerman, E. Saccharomyces cerevisiae and Saccharomyces paradoxus coexist in a natural woodland site in North America and display different levels of reproductive isolation from European conspecifics. FEMS Yeast Research. 1 (4), 299-306 (2002).
- Replansky, T., Koufopanou, V., Greig, D., Bell, G. Saccharomyces sensu stricto as a model system for evolution and ecology. Trends in Ecology and Evolution. 23 (9), 494-501 (2008).
- Greig, D. Reproductive isolation in Saccharomyces. Heredity. 102 (1), 39-44 (2009).
- Mayr, E. . Systematics and the Origin of Species, from the Viewpoint of a Zoologist. , (1999).
- Sprague, G. F. Assay of yeast mating reaction. Methods in Enzymology. 194, 77-93 (1991).
- McCaffrey, G., Clay, F. J., Kelsay, K., Sprague, G. F. Identification and regulation of a gene required for cell fusion during mating of the yeast Saccharomyces cerevisiae. Molecular and Cellular Biology. 7 (8), 2680-2690 (1987).
- Valtz, N., Peter, M., Herskowitz, I. FAR1 is required for oriented polarization of yeast cells in response to mating pheromones. Journal of Cell Biology. 131 (4), 863-873 (1995).
- Maclean, C. J., Greig, D. Prezygotic reproductive isolation between Saccharomyces cerevisiae and Saccharomyces paradoxus. BMC Evolutionary Biology. 8, 1 (2008).
- Murphy, H. A., Kuehne, H. A., Francis, C. A., Sniegowski, P. D. Mate choice assays and mating propensity differences in natural yeast populations. Biology Letters. 2 (4), 553-556 (2006).
- Leu, J. Y., Murray, A. W. Experimental evolution of mating discrimination in budding yeast. Current Biology. 16 (3), 280-286 (2006).
- Kim, J., Hirsch, J. P. A nucleolar protein that affects mating efficiency in Saccharomyces cerevisiae by altering the morphological response to pheromone. Genetics. 149 (2), 795-805 (1998).
- Jin, M., et al. Yeast dynamically modify their environment to achieve better mating efficiency. Science Signaling. 4 (186), (2011).
- Rogers, D. W., Denton, J. A., McConnell, E., Greig, D. Experimental evolution of species recognition. Current Biology. 25 (13), 1753-1758 (2015).
- McClure, A. W., Jacobs, K. C., Zyla, T. R., Lew, D. J. Mating in wild yeast: Delayed interest in sex after spore germination. Molecular Biology of the Cell. 29 (26), 3119-3127 (2018).
- Sena, E. P., Radin, D. N., Fogel, S. Synchronous mating in yeast. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 70 (5), 1373-1377 (1973).
- Werner-Washburne, M., Braun, E., Johnston, G. C., Singer, R. A. Stationary phase in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Microbiology Reviews. 57 (2), 383-401 (1993).
- Johnston, S. A., Hopper, J. E. Isolation of the yeast regulatory gene GAL4 and analysis of its dosage effects on the galactose/melibiose regulon. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 79 (22), 6971-6975 (1982).
- Mahilkar, A. . Study of metabolic specialization leading to speciation, using yeast as a model system. , (2021).
- Blank, T. E., Woods, M. P., Lebo, C. M., Xin, P., Hopper, J. E. Novel Gal3 proteins showing altered Gal80p binding cause constitutive transcription of Gal4p-activated genes in Saccharomyces cerevisiae. Molecular and Cellular Biology. 17 (5), 2566-2575 (1997).
- Rice, W. R., Hostert, E. E. Laboratory experiments on speciation: What have we learned in 40 years. Evolution. 47 (6), 1637-1653 (1993).
- White, N. J., Snook, R. R., Eyres, I. The past and future of experimental speciation. Trends in Ecology and Evolution. 35 (1), 10-21 (2020).
- Milo, R., Jorgensen, P., Moran, U., Weber, G., Springer, M. BioNumbers–The database of key numbers in molecular and cell biology. Nucleic Acids Research. 38, 750-753 (2010).
- Domitrovic, T., et al. Structural and functional study of YER067W, a new protein involved in yeast metabolism control and drug resistance. PLoS One. 5 (6), 11163 (2010).
- Lindegren, C. C., Spiegelman, S., Lindegren, G. Mendelian inheritance of adaptive enzymes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 30 (11), 346-352 (1944).
- Dettman, J. R., Sirjusingh, C., Kohn, L. M., Anderson, J. B. Incipient speciation by divergent adaptation and antagonistic epistasis in yeast. Nature. 447 (7144), 585-588 (2007).
- Jhuang, H. Y., Lee, H. Y., Leu, J. Y. Mitochondrial-nuclear co-evolution leads to hybrid incompatibility through pentatricopeptide repeat proteins. EMBO Reports. 18 (1), 87-101 (2017).
- Lee, H. Y., et al. Incompatibility of nuclear and mitochondrial genomes causes hybrid sterility between two yeast species. Cell. 135 (6), 1065-1073 (2008).
- Pronk, J. T. Auxotrophic yeast strains in fundamental and applied research. Applied and Environmental Microbiology. 68 (5), 2095-2100 (2002).
- Madhani, H. D. . From a to α: Yeast as a Model for Cellular Differentiation. , (2007).
- Huxley, C., Green, E. D., Dunham, I. Rapid assessment of S. cerevisiae mating type by PCR. Trends in Genetics. 6 (8), 236 (1990).
- Rang, C., Galen, J. E., Kaper, J. B., Chao, L. Fitness cost of the green fluorescent protein in gastrointestinal bacteria. Canadian Journal of Microbiology. 49 (9), 531-537 (2003).
- Tusso, S., Nieuwenhuis, B. P. S., Weissensteiner, B., Immler, S., Wolf, J. B. W. Experimental evolution of adaptive divergence under varying degrees of gene flow. Nature Ecology and Evolution. 5 (3), 338-349 (2021).
