Bestimmung der Paarungseffizienz von Haploiden in Saccharomyces cerevisiae

Summary

In dieser Arbeit wird eine robuste Methode zur Quantifizierung der Paarungseffizienz in der Hefe Saccharomyces cerevisiae beschrieben. Diese Methode eignet sich besonders für die Quantifizierung präzygotischer Barrieren in Artbildungsstudien.

Abstract

Saccharomyces cerevisiae ist ein weit verbreiteter Modellorganismus in Genetik, Evolution und Molekularbiologie. In den letzten Jahren hat es sich auch zu einem beliebten Modellorganismus entwickelt, um Probleme im Zusammenhang mit der Artbildung zu untersuchen. Der Lebenszyklus von Hefepilzen umfasst sowohl ungeschlechtliche als auch sexuelle Fortpflanzungsphasen. Die einfache Durchführung von Evolutionsexperimenten und die kurze Generationszeit des Organismus ermöglichen es, die Evolution von Fortpflanzungsbarrieren zu untersuchen. Der Wirkungsgrad, mit dem sich die beiden Steckarten (a und α) paaren, um das a/α-Diploid zu bilden, wird als Steckwirkungsgrad bezeichnet. Jede Abnahme der Paarungseffizienz zwischen Haploiden deutet auf eine präzygotische Barriere hin. Um das Ausmaß der reproduktiven Isolation zwischen zwei Haploiden zu quantifizieren, ist daher eine robuste Methode zur Quantifizierung der Paarungseffizienz erforderlich. Zu diesem Zweck wird hier ein einfaches und hochgradig reproduzierbares Protokoll vorgestellt. Das Protokoll umfasst vier Hauptschritte, darunter das Patchen der Haploiden auf einer YPD-Platte, das Mischen der Haploiden in gleicher Anzahl, das Verdünnen und Ausplattieren für einzelne Kolonien und schließlich die Berechnung der Effizienz basierend auf der Anzahl der Kolonien auf einer Drop-out-Platte. Auxotrophe Marker werden verwendet, um die Unterscheidung zwischen Haploiden und Diploiden klar zu machen.

Introduction

Saccharomyces cerevisiae, umgangssprachlich als knospende Hefe bezeichnet, ist ein einzelliger Eukaryot. Es hat zwei Paarungstypen, einen und einen α, und weist sowohl asexuelle als auch sexuelle Fortpflanzungszyklen auf. Die Paarungstypen a und α sind haploide und können sich mitotisch teilen, wenn der andere Paarungstyp in der Umgebung fehlt, der den ungeschlechtlichen Zyklus der Hefe darstellt. Wenn sich die beiden Paarungstypen in unmittelbarer Nähe befinden, hören sie auf, sich mitotisch zu teilen, und verschmelzen zu einer diploiden Zelle. Die diploide Hefe kann sich entweder mitotisch teilen, wenn Nährstoffe vorhanden sind, oder sich unter den Bedingungen des Stickstoffmangels in Gegenwart einer schlechten, nicht fermentierbaren Kohlenstoffquelle, wie z. B. Acetat¹, einer Meiose unterziehen. Dies führt zur Bildung von Sporen, die ruhen, bis günstige Wachstumsbedingungen herrschen. Der Lebenszyklus ist abgeschlossen, wenn diese Sporen keimen und die beiden haploiden Typen wieder in den haploiden Pool freigesetzt werden ^2,3 (Abbildung 1).

Die Paarung von Hefezellen umfasst mehrere Schritte, wie z.B. die Agglutination, die Bildung eines Paarungsvorsprungs oder “Shmoo”, gefolgt von der Zell– und Kernfusion ^4,5. Die beiden Paarungstypen a und α erzeugen einen a-Faktor bzw. einen α-Faktor, um die Paarung einzuleiten. Bei diesen Faktoren handelt es sich um Polypeptidpheromone, die an die Rezeptoren (Ste2 und Ste3) binden, die auf der Zelloberfläche des entgegengesetzten Paarungstyps⁵ vorhanden sind. Die Bindung der Pheromone an die Rezeptoren initiiert den Pheromon-Antwortweg, den Mitogen-aktivierten Proteinkinase (MAPK) Signaltransduktionsweg ^6,7,8. Dies führt zum Stillstand des Zellzyklus in der G1-Phase, was zu einer metabolisch aktiven stationären Phase⁹ führt. Die Zellen hören dann auf, sich mitotisch zu teilen, und die für die Paarung notwendigen Proteine werden synthetisiert. Da sich die haploiden Zellen nicht aufeinander zubewegen können, wird ein Paarungsvorsprung oder “Shmoo” auf den Paarungspartner gerichtet. Wenn die Zellen in Kontakt kommen, wird die Zellwand abgebaut und der zytoplasmatische Inhalt verschmilzt, was zur Paarung führt, um eine diploide Zelle^{zu bilden 10,11}. Die Paarungseffizienz zwischen Haploiden wurde als Maß für die Artbildung in im Labor entwickelten Stämmen sowie zwischen rezenten Arten verwendet¹².

Als einfacher eukaryotischer Organismus ist Hefe das Modell der Wahl für eine Vielzahl von Forschungsfragen im Zusammenhang mit komplexen eukaryotischen Organismen. Eine dieser Fragen ist mit der Artbildung und der Evolution von Fortpflanzungsbarrieren verbunden^13,14. Für sich sexuell fortpflanzende Organismen wird eine Art durch das von Ernst Mayr vorgeschlagene biologische Artkonzept (BSC) definiert¹⁵. Nach diesem Konzept werden zwei Individuen einer Population als zu zwei verschiedenen Arten gehörend bezeichnet, wenn sie sich nicht kreuzen können und fortpflanzungstechnisch isoliert sind. Der Zusammenbruch des sexuellen Fortpflanzungszyklus (der die Verschmelzung von Gameten zu einer Zygote, die Entwicklung der Zygote zu einer Nachkommenschaft und das Erreichen der Geschlechtsreife bei den Nachkommen umfasst) führt zu reproduktiver Isolation. Wie in Abbildung 1 dargestellt, ist der Lebenszyklus von S. cerevisiae vergleichbar mit dem sexuellen Fortpflanzungszyklus: a) Die Verschmelzung der beiden Paarungstypen a und α ähnelt der Verschmelzung von Gameten in sich sexuell fortpflanzenden Organismen; b) die Fähigkeit des Diploiden zur mitotischen Teilung ist gleichbedeutend mit der Entwicklung der Zygote zu Nachkommen; und c) die diploide Sporulation ist vergleichbar mit dem Prozess der Gametogenese¹⁴.

Eine präzygotische Isolation tritt auf, wenn eine assortative Paarung beobachtet wird. Bei gleicher Chance, sich mit zwei genetisch unterschiedlichen a-Typen zu paaren, paart sich ein α-Typ bevorzugt mit dem einen oder umgekehrt¹⁴. Im Falle von Evolutionsexperimenten, in denen Haploide in verschiedenen Umgebungen entwickelt wurden, kann das Vorhandensein einer Prä-Paarungsbarriere durch die Durchführung eines Paarungstests bestimmt werden. Eine Abnahme der Paarungseffizienz im Vergleich zum Vorgänger deutet auf die Evolution einer Barriere vor der Paarung hin. Eine postzygotische Isolierung könnte aufgrund der Unfähigkeit des Diploiden entstehen, eine effektive mitotische Teilung und/oder Sporulation zu durchlaufen, um haploide Sporen zu bilden¹⁴. Diese können quantifiziert werden, indem die Wachstumsrate der Diploiden gemessen bzw. die Sporulationseffizienz berechnet wird. Um die Evolution reproduktiver Barrieren zu untersuchen, sind daher robuste Methoden zur Quantifizierung (a) der Paarungseffizienz, (b) des mitotischen Wachstums des Diploiden und (c) der Sporulationseffizienz des Diploiden erforderlich. In dieser Arbeit wird eine robuste Methode zur Quantifizierung der Paarungseffizienz von Hefestämmen vorgestellt.

In Laborexperimenten kann das Auftreten von Paarungen unter anderem durch die Verwendung von auxotrophen Markern nachgewiesen werden, die den Nährstoffbedarf ergänzen. Wenn die beiden Paarungstypen für zwei verschiedene Aminosäuren auxotroph sind, kann nur die diploide Zelle, die durch die Fusion der beiden Paarungstypen gebildet wird, auf einem Medium wachsen, dem beide Aminosäuren fehlen. Daher sind auxotrophe Marker nützlich, um Paarungen sowohl qualitativ als auch quantitativ nachzuweisen. Ein qualitativer Test reicht aus, um den Paarungstyp eines Stammes nach Meiose^{zu bestimmen 16}. Quantitative Tests sind unerlässlich, wenn man daran interessiert ist, eine Verringerung der Paarung zu identifizieren und gleichzeitig die Gene zu untersuchen, die am Paarungsweg beteiligt sind^17,18. Da Hefe zunehmend in Artbildungsstudien verwendet wird, ist außerdem ein bequemer und reproduzierbarer Paarungstest erforderlich, da die Quantifizierung der Paarungseffizienz ein Maß für die präzygotische Barriere ist.

Die Paarungseffizienz zwischen den beiden Hefe-Paarungstypen wurde zuvor mit^16,19,20 quantifiziert. Die meisten der bisher verwendeten Methoden sind in ihrem Aufbau ähnlich mit einigen Variationen 16,21,22,23,24,25. Einige von ihnen verwenden Kulturen der frühen logarithmischen Phase, während einige andere Kulturen der mittleren logarithmischen Phase haploider Stämme verwenden. Es gibt Variationen in den Verhältnissen, in denen die beiden Steckarten gemischt werden. Fast alle Protokolle verwenden eine Nitrozellulosemembran. Suspensionen beider Paarungstypen aus zuvor gezüchteten Kulturen werden gemischt und auf eine Nitrozellulosemembran filtriert, die auf einer YPD-Platte platziert ist. In einer der Varianten des Protokolls wird die haploide Suspension direkt auf eine YPD-Platte²¹ geflickt. In Experimenten, die sich mit den Genen befassen, die an der Pheromonproduktion der beiden Paarungstypen beteiligt sind, werden die Pheromone extern hinzugefügt, während die Suspensionen der beiden Paarungstypen²⁴ gebildet werden.

Nach einer Inkubationszeit von einigen Stunden (typischerweise ca. 5 h) nach dem Mischen der Haploide werden die Zellen von der Membran abgewaschen, verdünnt und auf selektiven Medien plattiert. Bei einer der früheren Methoden, über die 1973 berichtet wurde, wurde die Effizienz der Zygotenbildung oder -paarung berechnet, indem die Anzahl der knospenden, nicht knospenden Zellen und Paarungspaare unter einem Mikroskop mit einem Hämozytometer^{gezählt wurde 26}. Die meisten Methoden, über die später berichtet wurde, verwenden jedoch auxotrophe Marker, um Haploide und Diploide zu unterscheiden. Die Paarungseffizienz wird berechnet als Prozentsatz der diploiden Zellen im Verhältnis zur Anzahl der diploiden und haploiden Zellen im Zellpool 16,21,23.

Trotz einer Reihe von Berichten, in denen Hefe als Modellorganismus zur Untersuchung der Artbildung verwendet wird, gibt es in der Literatur bisher kein standardisiertes Protokoll zur Berechnung der Effizienz der Paarung. Zellen in der logarithmischen Phase sind möglicherweise nicht ideal für die Quantifizierung der Paarungseffizienz. Während der Paarung wird der Zellzyklus der beiden Haploiden gestoppt, so dass sich die Zellen während der Paarung nicht teilen⁹. Da auch bekannt ist, dass der Zellzyklus in Zellen in der stationären Phase²⁷ in ähnlicher Weise angehalten wird, kann die Verwendung solcher Zellen das Protokoll reproduzierbarer machen. Stationäre Phasenzellen können gemischt und zur Paarung auf YPD-Platten (d.h. in einer nährstoffreichen Umgebung) ausgelegt werden. Die herkömmlichen Verfahren erfordern zudem eine Nitrozellulose-Membran und das Abwaschen der Zellen, was den Prozess umständlich und anfällig für Handhabungsfehler macht. Darüber hinaus quantifizieren die bisher verwendeten Protokolle die Paarungseffizienz in Form von einem Haploiden. Bei der Messung der reproduktiven Isolation wird die Paarungseffizienz jedoch für eine bestimmte Kombination von Haploiden und nicht für einen einzelnen Haploiden quantifiziert.

Um diese Probleme anzugehen, stellen wir hier eine robuste Methode zur Quantifizierung der Paarungseffizienz in Hefe vor, die hochgradig reproduzierbar und einfach anzuwenden ist. Darüber hinaus können diese Methode und die hier verwendeten Hefestämme auch in Studien eingesetzt werden, die den Einfluss des Genflusses auf die Evolution von Paarungsbarrieren untersuchen.

In dieser Studie wurden zwei verschiedene Stämme von S. cerevisiae verwendet. Einer der Stämme stammt aus dem SK1-Hintergrund; Dies wurde in unserem Labor modifiziert, indem die auxotrophen Marker in der Nähe des MAT-Locus hinzugefügt wurden. Die resultierenden Genotypen der Haploiden sind in Tabelle 1^28,29,30 dargestellt. Im SK1-Stamm war das TRP1-Gen in der Nähe des MAT-Locus eingefügt, und beim α haploiden hatte das LEU2-Gen in der Nähe des MAT-Locus eingefügt. Im ScAM-Stamm wurden die TRP1– und URA3-Gene in die a– bzw. α-Haploiden eingefügt. Der Ort der Insertion befand sich in der ARS-Region des Chromosoms III (Chr III: 197378..197609). Für das hier beschriebene Protokoll würden auxotrophe Marker an einer beliebigen Stelle des Genoms ausreichen. Da sich die auxotrophen Marker jedoch in der Nähe des MAT-Locus befinden, können diese Stämme auch für Studien verwendet werden, die den Einfluss des Genflusses auf die Artbildung untersuchen^31,32. Die Marker wurden in der Nähe des MAT-Locus hinzugefügt, um ein erneutes Mischen der Marker aufgrund von Rekombinationen zu verhindern. Daher kann dieses Protokoll verwendet werden, um die Paarungseffizienz in Studien mit Artbildung zu quantifizieren und auch um die Veränderung der Paarungseffizienz bei der Untersuchung der am Paarungsweg beteiligten Proteine zu identifizieren.

Protocol

ANMERKUNG: Das Protokoll umfasst im Großen und Ganzen die folgenden Schritte: (1) Patchen der Haploiden in den Paarungseffizienzgittern auf einer YPD-Platte, (2) Mischen der Haploiden in gleicher Anzahl nach 24-stündiger Inkubation und Geben der gemischten Haploiden einige Stunden Zeit zur Paarung (7 h in dieser Studie), (3) Ausplattieren der gemischten Zellen auf YPD zur Isolierung einzelner Kolonien nach 7 h bei 30 °C, und schließlich (4) die Bestimmung der Anzahl der gebildeten Diploiden unter Verwendung der auxo…

Representative Results

Quantifizierung der Steckeffizienz der beiden SteckartenDas hier beschriebene Protokoll wurde verwendet, um die Paarungseffizienz zwischen zwei Hefestämmen zu quantifizieren – zwischen SK1AM a und SK1AM α und zwischen ScAMa und ScAMα (Abbildung 3A). In diesen Experimenten wurde die Paarung zwischen den beiden Haploiden mindestens 12 Mal wiederholt. In jeder Wiederholung des Experiments wurden mindeste…

Discussion

Die Quantifizierung der Paarungseffizienz in S. cerevisiae ist essentiell für die Durchführung von Studien zu den Genen, die an Paarungswegen beteiligt sind, oder für die Untersuchung des Einflusses der äußeren Umgebung auf das Paarungsverhalten. In den letzten zwei Jahrzehnten hat sich S. cerevisiae auch zu einem beliebten Modell entwickelt, um Fragen im Zusammenhang mit der Artbildung zu beantworten 14,36,37,38.<sup class="xref…

Materials

Adenine	Sigma Life Science	A8626
Agar Powder regular grade for bacteriology	SRL	19661 (0140186)
Ammonium Sulphate, Hi-AR	HiMedia	GRM1273
D-(+)-glucose	Sigma Life Science	G8270
Glass Petri plates	HiMedia	PW008	90 mm x 15 mm dimension
L-Arginine	Sigma Life Science	A8094
L-Aspartic acid	Sigma Life Science	A7219
L-Histidine monochloride monohydrate	Sigma Life Science	H5659
L-Isoleucine	Sigma Aldrich	I2752
L-Leucine	Sigma Life Science	L8912
L-Lysine	Aldrich	62840
L-Methionine	Sigma Life Science	M5308
L-Phenylalanine	Sigma Life Science	P5482
L-Threonine	Sigma Aldrich	T8625
L-Tyrosine	Sigma Life Science	T8566
L-Valine	Sigma Life Science	V0513
Mating efficiency grid			1 cm x 1.5 cm rectangular grid drawn on the Petri plate
Microcentrifuge tubes	Tarsons	500010
Peptone	HiMedia	RM001
Uracil	Sigma Life Science	U0750
Yeast Extract Powder	HiMedia	RM027
Yeast Nitrogen Base w/o Amino acids and Ammonium Sulphate	BD Difco	233520