L'impianto ortotopico di cellule tumorali derivate dal paziente nei topi ricapitola il cancro colorettale avanzato
Summary
Questo protocollo descrive l’impianto ortotopico di cellule tumorali derivate dal paziente nella parete cieca di topi immunodeficienti. Il modello ricapitola la malattia metastatica del carcinoma colorettale avanzato e consente la valutazione di nuovi farmaci terapeutici in uno scenario clinicamente rilevante di metastasi polmonari ed epatiche.
Abstract
Nell’ultimo decennio, sono stati stabiliti modelli preclinici più sofisticati per il cancro del colon-retto (CRC) utilizzando cellule tumorali derivate da pazienti e tumori 3D. Poiché gli organoidi tumorali derivati dal paziente possono mantenere le caratteristiche del tumore originale, questi modelli preclinici affidabili consentono lo screening dei farmaci antitumorali e lo studio dei meccanismi di resistenza ai farmaci. Tuttavia, la morte correlata al CRC nei pazienti è per lo più associata alla presenza di malattia metastatica. È quindi essenziale valutare l’efficacia delle terapie antitumorali in modelli in vivo che ricapitolino realmente le caratteristiche molecolari chiave delle metastasi tumorali umane. Abbiamo stabilito un modello ortotopico basato sull’iniezione di cellule tumorali derivate da pazienti affetti da CRC direttamente nella parete cieca dei topi. Queste cellule tumorali sviluppano tumori primari nel cieco che metastatizzano al fegato e ai polmoni, che si osservano frequentemente nei pazienti con CRC avanzato. Questo modello murino di CRC può essere utilizzato per valutare le risposte ai farmaci monitorate mediante tomografia microcomputerizzata (μCT), un metodo di imaging su piccola scala clinicamente rilevante in grado di identificare facilmente tumori primari o metastasi nei pazienti. Qui, descriviamo la procedura chirurgica e la metodologia necessaria per impiantare cellule tumorali derivate dal paziente nella parete cieca di topi immunodeficienti.
Introduction
Il cancro del colon-retto (CRC) è la seconda causa di morte per cancro in tutto il mondo1. La capacità di generare modelli tumorali in vitro o in vivo derivati da cellule tumorali di singoli pazienti ha fatto progredire la medicina di precisione in oncologia. Nell’ultimo decennio, gli organoidi derivati da pazienti (PDO) o xenotrapianti (PDX) sono stati utilizzati da molti gruppi di ricerca in tutto il mondo2. I PDO sono strutture multicellulari in vitro che assomigliano alle caratteristiche del tessuto tumorale originale e possono auto-organizzarsi e auto-rinnovarsi3. Questi promettenti modelli in vitro possono essere utilizzati con successo per lo screening dei farmaci e per facilitare la ricerca traslazionale. D’altra parte, i modelli PDX ricapitolano fedelmente il CRC originale a tutti i livelli rilevanti, dall’istologia ai tratti molecolari e alla risposta ai farmaci 2,4.
In vivo I modelli PDX sono per lo più coltivati come tumori sottocutanei in topi immunodeficienti. Utilizzando questo approccio, i PDX sono diventati il gold standard nella ricerca sul cancro, in particolare per lo studio della sensibilità o della resistenza ai farmaci. Tuttavia, i decessi correlati al CRC sono per lo più associati alla presenza di lesioni metastatiche nel fegato, nel polmone o nella cavità peritoneale e nessuno dei due approcci (PDO o PDX) può ricapitolare il setting clinico avanzato. Inoltre, è stato dimostrato che il sito specifico di crescita del tumore determina importanti caratteristiche biologiche che hanno un impatto sull’efficacia dei farmaci e sulla prognosi della malattia2. Pertanto, vi è un urgente bisogno di stabilire modelli preclinici che possano essere utilizzati per valutare l’efficacia dei farmaci antitumorali in un contesto metastatico clinicamente rilevante6.
Gli scanner per tomografia microcomputerizzata (μCT) possono funzionare come scanner TC clinici in scala ridotta, fornendo imaging di tumori primari e metastasi nei topi con una risoluzione dell’immagine in scala proporzionale a quella delle immagini TC dei pazienti oncologici7. Per contrastare lo scarso contrasto dei tessuti molli della tecnica μCT, è possibile utilizzare mezzi di contrasto iodati radiologici per migliorare il contrasto e valutare il carico tumorale. Utilizzando un approccio a doppio contrasto, lo iodio orale e intraperitoneale viene somministrato in tempi diversi. Il mezzo di contrasto somministrato per via orale aiuta a definire i limiti tra il tessuto tumorale e il contenuto del cieco all’interno dell’intestino. D’altra parte, il mezzo di contrasto somministrato per via intraperitoneale permette di individuare i limiti esterni della massa tumorale, che frequentemente cresce e invade il peritoneo8.
Il manoscritto descrive un protocollo per eseguire l’impianto ortotopico di cellule tumorali derivate da pazienti nella parete cieca di topi immunodeficienti e la metodologia per monitorare la crescita del tumore intestinale utilizzando la scansione μCT. Il presente manoscritto mostra che il modello ricapitola lo scenario clinico dei tumori intestinali avanzati e della malattia metastatica nei pazienti affetti da CRC che non possono essere studiati utilizzando modelli PDO o PDXO. Poiché i modelli ortotopici PDX di CRC ricapitolano lo scenario clinico dei pazienti con CRC, concludiamo che sono i migliori ad oggi per testare l’efficacia dei farmaci antitumorali nei tumori intestinali avanzati e nella malattia metastatica.
Protocol
Representative Results
Discussion
Negli ultimi decenni, molte nuove terapie antitumorali sono state sviluppate e testate in pazienti con diversi tipi di tumore, incluso il cancro del colon-retto (CRC). Sebbene in molti casi siano stati osservati risultati promettenti nei modelli preclinici, l’efficacia terapeutica nei pazienti con CRC metastatico avanzato è stata spesso limitata. Pertanto, vi è un urgente bisogno di modelli preclinici che consentano di testare l’efficacia di nuovi farmaci terapeutici in uno scenario metastatico clinicamente rilevante.<…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo la Fondazione Cellex, la rete CIBERONC e l’Instituto de Salud Carlos III per il loro sostegno. Inoltre, ringraziamo anche la piattaforma di imaging preclinico presso l’Istituto di Ricerca Vall d’Hebron (VHIR), dove sono stati eseguiti gli esperimenti.
Materials
| REAGENT | |||
| Apo-Transferrin | MERCK LIFE SCIENCE S.L.U. | T1147-500MG | |
| B27 Supplement | Life Technologies S.A (Spain) | 17504044 | |
| Chlorhexidine Aqueous Solution 2% | DH MATERIAL MÉDICO, S.L. | 1111696250 | |
| Collagenase | MERCK LIFE SCIENCE S.L.U. | C0130-500MG | |
| D-(+)-Glucose | MERCK LIFE SCIENCE S.L.U. | G6152 | |
| DMEM /F12 | LIFE TECHNOLOGIES S.A. | 21331-020 | |
| DNase I | MERCK LIFE SCIENCE S.L.U. | D4263-5VL | |
| EGF | PEPRO TECH EC LTD. | AF-100-15-500 µg | |
| FGF basic | PEPRO TECH EC LTD. | 100-18B | |
| Fungizone | Life Technologies S.A (Spain) | 15290026 | |
| Gentamycin | LIFE TECHNOLOGIES S.A. | 15750037 | |
| Heparin Sodium Salt | MERCK LIFE SCIENCE S.L.U. | H4784-250MG | |
| Insulin | MERCK LIFE SCIENCE S.L.U. | I9278-5ML | |
| Iopamiro | |||
| Isoflurane | – | – | |
| Kanamycin | LIFE TECHNOLOGIES S.A. | 15160047 | |
| L-Glutamine | LIFE TECHNOLOGIES S.A. | 25030032 | |
| Matrigel Matrix | CULTEK, S.L.U. | 356235/356234/354234 | |
| Metacam, 5 mg/mL | – | – | |
| Non-essential amino acids | LIFE TECHNOLOGIES S.A. | 11140035 | |
| Nystatin | MERCK LIFE SCIENCE S.L.U. | N4014-50MG | |
| Pen/Strep | Life Technologies S.A (Spain) | 15140122 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS), sterile | Labclinics S.A | L0615-500 | |
| Progesterone | MERCK LIFE SCIENCE S.L.U. | P0130-25G | |
| Putrescine | MERCK LIFE SCIENCE S.L.U. | P5780-5G | |
| RBC Lysis Buffer | Labclinics S.A | 00-4333-57 | |
| Sodium Pyruvate | LIFE TECHNOLOGIES S.A. | 11360039 | |
| Sodium Selenite | MERCK LIFE SCIENCE S.L.U. | S5261-25G | |
| ESSENTIAL SUPPLIES | |||
| 8 weeks-old NOD.CB17-Prkdcscid/NcrCrl mice | – | – | |
| BD Micro-Fine 0.5 ml U 100 needle 0.33 mm (29G) x 12.7 mm | BECTON DICKINSON, S.A.U. | 320926 | |
| Blade #24 | – | – | |
| Cell Strainer 100 µm | Cultek, SLU | 45352360 | |
| Forceps and Surgical scissors | – | – | |
| Heating pad | – | – | |
| Lacryvisc, 3 mg/g, ophthalmic gel | – | – | |
| Surfasafe | – | – | |
| Suture PROLENE 5-0 | JOHNSON&JOHNSON S, A. | 8720H | |
| EQUIPMENT/SOFTWARE | |||
| Quantum FX µCT Imaging system | Perkin Elmer | Perkin Elmer | http://www.perkinelmer.com/es/product/quantum-gx-instrument-120-240-cls140083 |
References
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