Farelerde Hasta Kaynaklı Kanser Hücrelerinin Ortotopik İmplantasyonu, İleri Kolorektal Kanseri Özetliyor
Summary
Bu protokol, immün yetmezliği olan farelerin çekum duvarına hasta kaynaklı kanser hücrelerinin ortotopik implantasyonunu açıklar. Model, ilerlemiş kolorektal kanser metastatik hastalığını özetler ve klinik olarak anlamlı bir akciğer ve karaciğer metastazı senaryosunda yeni terapötik ilaçların değerlendirilmesine izin verir.
Abstract
Son on yılda, hasta kaynaklı kanser hücreleri ve 3D tümöroidler kullanılarak daha karmaşık klinik öncesi kolorektal kanser (KRK) modelleri oluşturulmuştur. Hasta kaynaklı tümör organoidleri orijinal tümörün özelliklerini koruyabildiğinden, bu güvenilir preklinik modeller kanser ilacı taramasını ve ilaç direnç mekanizmalarının incelenmesini sağlar. Bununla birlikte, hastalarda KRK’ye bağlı ölüm çoğunlukla metastatik hastalık varlığı ile ilişkilidir. Bu nedenle, anti-kanser tedavilerinin etkinliğini, insan kanseri metastazının temel moleküler özelliklerini gerçekten özetleyen ilgili in vivo modellerde değerlendirmek önemlidir. CRC hastadan türetilen kanser hücrelerinin doğrudan farelerin çekum duvarına enjekte edilmesine dayanan bir ortotopik model oluşturduk. Bu tümör hücreleri, çekumda karaciğer ve akciğerlere metastaz yapan primer tümörler geliştirir ve bu durum ilerlemiş KRK’li hastalarda sıklıkla görülür. Bu CRC fare modeli, hastalarda primer tümörleri veya metastazları kolayca tanımlayabilen, klinik olarak anlamlı küçük ölçekli bir görüntüleme yöntemi olan mikrobilgisayarlı tomografi (μCT) ile izlenen ilaç yanıtlarını değerlendirmek için kullanılabilir. Burada, immün yetmezliği olan farelerin çekum duvarına hasta kaynaklı kanser hücrelerini implante etmek için cerrahi prosedürü ve gerekli metodolojiyi açıklıyoruz.
Introduction
Kolorektal kanser (KRK), dünya çapında kanser ölümlerinin ikinci önde gelen nedenidir1. Bireysel hasta tümör hücrelerinden türetilen in vitro veya in vivo tümör modelleri üretme yeteneği, onkolojide gelişmiş hassas tıbba sahiptir. Son on yılda, hasta kaynaklı organoidler (PDO’lar) veya ksenogreftler (PDX’ler) dünya çapında birçok araştırma grubu tarafından kullanılmıştır2. PDO’lar, orijinal tümör dokusunun özelliklerine benzeyen, kendi kendini organize edebilen ve yenileyebilen çok hücreli in vitro yapılardır3. Bu umut verici in vitro modeller, ilaç taraması ve translasyonel araştırmaları kolaylaştırmak için başarıyla kullanılabilir. Öte yandan, PDX modelleri, orijinal CRC’yi histolojiden moleküler özelliklere ve ilaç yanıtınakadar ilgili tüm seviyelerde aslına uygun olarak özetlemektedir 2,4.
İn vivo PDX modelleri çoğunlukla immün yetmezliği olan farelerde deri altı tümörler olarak büyütülür. Bu yaklaşımı kullanarak, PDX’ler, özellikle ilaç duyarlılığını veya direncini incelemek için kanser araştırmalarında altın standart haline gelmiştir. Bununla birlikte, KRK ile ilişkili ölümler çoğunlukla karaciğer, akciğer veya periton boşluğunda metastatik lezyonların varlığı ile ilişkilidir ve iki yaklaşımın hiçbiri (PDO veya PDX) ileri klinik ortamı özetleyemez. Ek olarak, spesifik tümör büyüme bölgesinin, ilaç etkinliği ve hastalık prognozu üzerinde etkisi olan önemli biyolojik özellikleri belirlediği gösterilmiştir2. Bu nedenle, klinik olarak anlamlı bir metastatik ortamda antikanser ilaçların etkinliğini değerlendirmek için kullanılabilecek klinik öncesi modellerin oluşturulmasına acil bir ihtiyaç vardır6.
Mikrobilgisayarlı tomografi (μCT) tarayıcıları, kanser hastalarının BT görüntüleriyle orantılı ölçekli bir görüntü çözünürlüğünde farelerde primer tümör ve metastaz görüntülemesi sağlayan küçültülmüş klinik BT tarayıcıları olarak işlev görebilir7. μCT tekniğinin zayıf yumuşak doku kontrastına karşı koymak için, kontrastı iyileştirmek ve tümör yükünü değerlendirmek için radyolojik iyotlu kontrast ajanlar kullanılabilir. İkili kontrast yaklaşımı kullanılarak, oral ve intraperitoneal iyot farklı zamanlamalarda uygulanır. Ağızdan uygulanan kontrast, bağırsak içindeki tümör dokusu ve çekum içeriği arasındaki sınırları tanımlamaya yardımcı olur. Öte yandan, intraperitoneal olarak uygulanan kontrast, sıklıkla büyüyen ve peritonu invaze eden tümör kitlesinin dış sınırlarının belirlenmesine olanak tanır8.
Makale, immün yetmezliği olan farelerin çekum duvarına hasta kaynaklı kanser hücrelerinin ortotopik implantasyonunu gerçekleştirmek için bir protokolü ve μCT taraması kullanarak bağırsak tümörü büyümesini izleme metodolojisini açıklamaktadır. Bu makale, modelin PDO veya PDXO modelleri kullanılarak çalışılamayan KRK hastalarında ileri intestinal tümörler ve metastatik hastalıkların klinik senaryosunu özetlediğini göstermektedir. KRK’nin ortotopik PDX modelleri, KRK hastalarının klinik senaryosunu özetlediğinden, ileri intestinal tümörlerde ve metastatik hastalıkta anti-tümöral ilaçların etkinliğini test etmek için bugüne kadarki en iyi modeller oldukları sonucuna vardık.
Protocol
Representative Results
Discussion
Son birkaç on yılda, kolorektal kanser (KRK) dahil olmak üzere farklı tümör tiplerine sahip hastalarda birçok yeni anti-kanser tedavisi geliştirilmiş ve test edilmiştir. Birçok vakada klinik öncesi modellerde umut verici sonuçlar gözlenmesine rağmen, ileri metastatik KRK’li hastalarda terapötik etkinlik sıklıkla sınırlı kalmıştır. Bu nedenle, klinik olarak anlamlı bir metastatik senaryoda yeni terapötik ilaçların etkinliğinin test edilmesine izin veren klinik öncesi modellere acil bir ihtiya…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Cellex Vakfı’na, CIBERONC ağına ve Instituto de Salud Carlos III’e destekleri için teşekkür ederiz. Ayrıca, deneylerin yapıldığı Vall d’Hebron Araştırma Enstitüsü’ndeki (VHIR) klinik öncesi görüntüleme platformuna da teşekkür ediyoruz.
Materials
| REAGENT | |||
| Apo-Transferrin | MERCK LIFE SCIENCE S.L.U. | T1147-500MG | |
| B27 Supplement | Life Technologies S.A (Spain) | 17504044 | |
| Chlorhexidine Aqueous Solution 2% | DH MATERIAL MÉDICO, S.L. | 1111696250 | |
| Collagenase | MERCK LIFE SCIENCE S.L.U. | C0130-500MG | |
| D-(+)-Glucose | MERCK LIFE SCIENCE S.L.U. | G6152 | |
| DMEM /F12 | LIFE TECHNOLOGIES S.A. | 21331-020 | |
| DNase I | MERCK LIFE SCIENCE S.L.U. | D4263-5VL | |
| EGF | PEPRO TECH EC LTD. | AF-100-15-500 µg | |
| FGF basic | PEPRO TECH EC LTD. | 100-18B | |
| Fungizone | Life Technologies S.A (Spain) | 15290026 | |
| Gentamycin | LIFE TECHNOLOGIES S.A. | 15750037 | |
| Heparin Sodium Salt | MERCK LIFE SCIENCE S.L.U. | H4784-250MG | |
| Insulin | MERCK LIFE SCIENCE S.L.U. | I9278-5ML | |
| Iopamiro | |||
| Isoflurane | – | – | |
| Kanamycin | LIFE TECHNOLOGIES S.A. | 15160047 | |
| L-Glutamine | LIFE TECHNOLOGIES S.A. | 25030032 | |
| Matrigel Matrix | CULTEK, S.L.U. | 356235/356234/354234 | |
| Metacam, 5 mg/mL | – | – | |
| Non-essential amino acids | LIFE TECHNOLOGIES S.A. | 11140035 | |
| Nystatin | MERCK LIFE SCIENCE S.L.U. | N4014-50MG | |
| Pen/Strep | Life Technologies S.A (Spain) | 15140122 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS), sterile | Labclinics S.A | L0615-500 | |
| Progesterone | MERCK LIFE SCIENCE S.L.U. | P0130-25G | |
| Putrescine | MERCK LIFE SCIENCE S.L.U. | P5780-5G | |
| RBC Lysis Buffer | Labclinics S.A | 00-4333-57 | |
| Sodium Pyruvate | LIFE TECHNOLOGIES S.A. | 11360039 | |
| Sodium Selenite | MERCK LIFE SCIENCE S.L.U. | S5261-25G | |
| ESSENTIAL SUPPLIES | |||
| 8 weeks-old NOD.CB17-Prkdcscid/NcrCrl mice | – | – | |
| BD Micro-Fine 0.5 ml U 100 needle 0.33 mm (29G) x 12.7 mm | BECTON DICKINSON, S.A.U. | 320926 | |
| Blade #24 | – | – | |
| Cell Strainer 100 µm | Cultek, SLU | 45352360 | |
| Forceps and Surgical scissors | – | – | |
| Heating pad | – | – | |
| Lacryvisc, 3 mg/g, ophthalmic gel | – | – | |
| Surfasafe | – | – | |
| Suture PROLENE 5-0 | JOHNSON&JOHNSON S, A. | 8720H | |
| EQUIPMENT/SOFTWARE | |||
| Quantum FX µCT Imaging system | Perkin Elmer | Perkin Elmer | http://www.perkinelmer.com/es/product/quantum-gx-instrument-120-240-cls140083 |
References
- Sung, H., et al. Global Cancer Statistics 2020: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA: a Cancer Journal for Clinicians. 71 (3), 209-249 (2021).
- Puig, I., et al. A personalized preclinical model to evaluate the metastatic potential of patient-derived colon cancer initiating cells. Clinical Cancer Research. 19 (24), 6787-6801 (2013).
- Clevers, H. Modeling development and disease with organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
- Byrne, A. T., et al. Interrogating open issues in cancer precision medicine with patient-derived xenografts. Nature Reviews. Cancer. 17 (4), 254-268 (2017).
- Vatandoust, S., Price, T. J., Karapetis, C. S. Colorectal cancer: Metastases to a single organ. World Journal of Gastroenterology. 21 (41), 11767-11776 (2015).
- Cespedes, M. V., et al. Orthotopic microinjection of human colon cancer cells in nude mice induces tumor foci in all clinically relevant metastatic sites. The American Journal of Pathology. 170 (3), 1077-1085 (2007).
- Durkee, B. Y., Weichert, J. P., Halberg, R. B. Small animal micro-CT colonography. Methods. 50 (1), 36-41 (2010).
- Boll, H., et al. Double-contrast micro-CT colonoscopy in live mice. International Journal of Colorectal Disease. 26 (6), 721-727 (2011).
- O’Brien, C. A., Pollett, A., Gallinger, S., Dick, J. E. A human colon cancer cell capable of initiating tumour growth in immunodeficient mice. Nature. 445 (7123), 106-110 (2007).
- Jensen, M. M., Jorgensen, J. T., Binderup, T., Kjaer, A. Tumor volume in subcutaneous mouse xenografts measured by microCT is more accurate and reproducible than determined by 18F-FDG-microPET or external caliper. BMC Medical Imaging. 8, 16 (2008).
- Herpers, B., et al. Functional patient-derived organoid screenings identify MCLA-158 as a therapeutic EGFR x LGR5 bispecific antibody with efficacy in epithelial tumors. Nature Cancer. 3 (4), 418-436 (2022).
- Chicote, I., Camara, J. A., Palmer, H. G. Advanced colorectal cancer orthotopic patient-derived xenograft models for cancer and stem cell research. Methods in Molecular Biology. 2171, 321-329 (2020).
