Implante Ortotópico de Células Cancerosas Derivadas do Paciente em Camundongos Recapitula o Câncer Colorretal Avançado
Summary
Este protocolo descreve o implante ortotópico de células cancerosas derivadas de pacientes na parede do ceco de camundongos imunodeficientes. O modelo recapitula a doença metastática avançada do câncer colorretal e permite a avaliação de novas drogas terapêuticas em um cenário clinicamente relevante de metástases pulmonares e hepáticas.
Abstract
Na última década, modelos mais sofisticados de câncer colorretal (CCR) pré-clínicos foram estabelecidos usando células cancerosas derivadas do paciente e tumoroides 3D. Uma vez que organoides tumorais derivados do paciente podem manter as características do tumor original, esses modelos pré-clínicos confiáveis permitem o rastreamento de drogas para câncer e o estudo de mecanismos de resistência a drogas. No entanto, a morte relacionada ao CCR em pacientes está associada principalmente à presença de doença metastática. Portanto, é essencial avaliar a eficácia de terapias anticâncer em modelos in vivo relevantes que realmente recapitulem as principais características moleculares da metástase de câncer humano. Estabelecemos um modelo ortotópico baseado na injeção de células cancerosas derivadas do paciente com CCR diretamente na parede do ceco de camundongos. Essas células tumorais desenvolvem tumores primários no ceco que metastatizam para o fígado e pulmões, o que é frequentemente observado em pacientes com CCR avançado. Este modelo de CRC em camundongos pode ser usado para avaliar as respostas a drogas monitoradas por tomografia microcomputadorizada (μCT), um método de imagem em pequena escala clinicamente relevante que pode facilmente identificar tumores primários ou metástases em pacientes. Aqui, descrevemos o procedimento cirúrgico e a metodologia necessária para implantar células cancerosas derivadas do paciente na parede do ceco de camundongos imunodeficientes.
Introduction
O câncer colorretal (CCR) é a segunda causa de morte por câncer nomundo1. A capacidade de gerar modelos tumorais in vitro ou in vivo derivados de células tumorais individuais de pacientes tem avançado a medicina de precisão em oncologia. Na última década, organoides derivados de pacientes (DOPs) ou xenoenxertos (PDXs) têm sido utilizados por muitos grupos de pesquisa em todo omundo2. As DOPs são estruturas multicelulares in vitro que se assemelham às características do tecido tumoral original e podem se auto-organizar e se auto-renovar3. Esses promissores modelos in vitro podem ser usados com sucesso para triagem de fármacos e facilitar a pesquisa translacional. Por outro lado, os modelos PDX recapitulam fielmente o CCR original em todos os níveis relevantes, desde a histologia até as características moleculares e a resposta a drogas 2,4.
In vivo Os modelos PDX são principalmente cultivados como tumores subcutâneos em camundongos imunodeficientes. Usando essa abordagem, PDXs tornaram-se o padrão-ouro na pesquisa do câncer, particularmente para estudar a sensibilidade ou resistência a drogas. No entanto, as mortes relacionadas ao CCR estão principalmente associadas à presença de lesões metastáticas no fígado, no pulmão ou na cavidade peritoneal, e nenhuma das duas abordagens (DOP ou PDX) pode recapitular o quadro clínico avançado. Além disso, demonstrou-se que o sítio específico de crescimento tumoral determina características biológicas importantes que têm impacto na eficácia da droga e no prognóstico dadoença2. Portanto, há uma necessidade urgente de estabelecer modelos pré-clínicos que possam ser usados para avaliar a eficácia de drogas antineoplásicas em um cenário metastático clinicamente relevante6.
Os tomógrafos microcomputadorizados (μCT) podem funcionar como tomógrafos clínicos reduzidos, fornecendo imagens de tumor primário e metástase em camundongos com uma resolução de imagem em escala proporcional à das imagens de TC de pacientes comcâncer7. Para neutralizar o baixo contraste de partes moles da técnica de μCT, agentes de contraste iodados radiológicos podem ser usados para melhorar o contraste e avaliar a carga tumoral. Usando uma abordagem de duplo contraste, iodo oral e intraperitoneal é administrado em diferentes momentos. O contraste administrado por via oral ajuda a definir os limites entre o tecido tumoral e o conteúdo ceco no interior do intestino. Por outro lado, o contraste administrado por via intraperitoneal permite a identificação dos limites externos da massa tumoral, que frequentemente cresce e invade operitônio8.
O manuscrito descreve um protocolo para realizar implante ortotópico de células cancerosas derivadas de pacientes na parede do ceco de camundongos imunodeficientes e a metodologia para monitorar o crescimento de tumores intestinais usando a tomografia computadorizada. O presente artigo mostra que o modelo recapitula o cenário clínico de tumores intestinais avançados e doença metastática em pacientes com CCR que não podem ser estudados usando modelos DOP ou PDXO. Uma vez que os modelos PDX ortotópicos de CCR recapitulam o cenário clínico de pacientes com CCR, concluímos que eles são os melhores até o momento para testar a eficácia de drogas antitumorais em tumores intestinais avançados e doença metastática.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nas últimas décadas, muitas novas terapias antineoplásicas têm sido desenvolvidas e testadas em pacientes com diferentes tipos de tumores, incluindo o câncer colorretal (CCR). Embora resultados promissores em modelos pré-clínicos tenham sido observados em muitos casos, a eficácia terapêutica em pacientes com CCR metastático avançado tem sido frequentemente limitada. Portanto, há uma necessidade urgente de modelos pré-clínicos que permitam testar a eficácia de novas drogas terapêuticas em um cenário metas…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos à Fundação Cellex , à rede CIBERONC e ao Instituto de Salud Carlos III pelo apoio. Além disso, agradecemos também à plataforma de imagem pré-clínica do Vall d’Hebron Research Institute (VHIR), onde os experimentos foram realizados.
Materials
| REAGENT | |||
| Apo-Transferrin | MERCK LIFE SCIENCE S.L.U. | T1147-500MG | |
| B27 Supplement | Life Technologies S.A (Spain) | 17504044 | |
| Chlorhexidine Aqueous Solution 2% | DH MATERIAL MÉDICO, S.L. | 1111696250 | |
| Collagenase | MERCK LIFE SCIENCE S.L.U. | C0130-500MG | |
| D-(+)-Glucose | MERCK LIFE SCIENCE S.L.U. | G6152 | |
| DMEM /F12 | LIFE TECHNOLOGIES S.A. | 21331-020 | |
| DNase I | MERCK LIFE SCIENCE S.L.U. | D4263-5VL | |
| EGF | PEPRO TECH EC LTD. | AF-100-15-500 µg | |
| FGF basic | PEPRO TECH EC LTD. | 100-18B | |
| Fungizone | Life Technologies S.A (Spain) | 15290026 | |
| Gentamycin | LIFE TECHNOLOGIES S.A. | 15750037 | |
| Heparin Sodium Salt | MERCK LIFE SCIENCE S.L.U. | H4784-250MG | |
| Insulin | MERCK LIFE SCIENCE S.L.U. | I9278-5ML | |
| Iopamiro | |||
| Isoflurane | – | – | |
| Kanamycin | LIFE TECHNOLOGIES S.A. | 15160047 | |
| L-Glutamine | LIFE TECHNOLOGIES S.A. | 25030032 | |
| Matrigel Matrix | CULTEK, S.L.U. | 356235/356234/354234 | |
| Metacam, 5 mg/mL | – | – | |
| Non-essential amino acids | LIFE TECHNOLOGIES S.A. | 11140035 | |
| Nystatin | MERCK LIFE SCIENCE S.L.U. | N4014-50MG | |
| Pen/Strep | Life Technologies S.A (Spain) | 15140122 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS), sterile | Labclinics S.A | L0615-500 | |
| Progesterone | MERCK LIFE SCIENCE S.L.U. | P0130-25G | |
| Putrescine | MERCK LIFE SCIENCE S.L.U. | P5780-5G | |
| RBC Lysis Buffer | Labclinics S.A | 00-4333-57 | |
| Sodium Pyruvate | LIFE TECHNOLOGIES S.A. | 11360039 | |
| Sodium Selenite | MERCK LIFE SCIENCE S.L.U. | S5261-25G | |
| ESSENTIAL SUPPLIES | |||
| 8 weeks-old NOD.CB17-Prkdcscid/NcrCrl mice | – | – | |
| BD Micro-Fine 0.5 ml U 100 needle 0.33 mm (29G) x 12.7 mm | BECTON DICKINSON, S.A.U. | 320926 | |
| Blade #24 | – | – | |
| Cell Strainer 100 µm | Cultek, SLU | 45352360 | |
| Forceps and Surgical scissors | – | – | |
| Heating pad | – | – | |
| Lacryvisc, 3 mg/g, ophthalmic gel | – | – | |
| Surfasafe | – | – | |
| Suture PROLENE 5-0 | JOHNSON&JOHNSON S, A. | 8720H | |
| EQUIPMENT/SOFTWARE | |||
| Quantum FX µCT Imaging system | Perkin Elmer | Perkin Elmer | http://www.perkinelmer.com/es/product/quantum-gx-instrument-120-240-cls140083 |
References
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