Ortotopisk implantasjon av pasientavledede kreftceller hos mus rekapitulerer avansert kolorektal kreft
Summary
Denne protokollen beskriver den ortotopiske implantasjonen av pasientavledede kreftceller i cecumveggen hos immundefekte mus. Modellen rekapitulerer avansert metastatisk sykdom i kolorektal kreft og muliggjør evaluering av nye terapeutiske legemidler i et klinisk relevant scenario for lunge- og levermetastaser.
Abstract
I løpet av det siste tiåret har mer sofistikerte prekliniske kolorektal kreft (CRC) modeller blitt etablert ved hjelp av pasientavledede kreftceller og 3D-tumoroider. Siden pasientavledede tumororganoider kan beholde egenskapene til den opprinnelige svulsten, muliggjør disse pålitelige prekliniske modellene screening av kreftmedisiner og studiet av legemiddelresistensmekanismer. Imidlertid er CRC-relatert død hos pasienter hovedsakelig forbundet med tilstedeværelsen av metastatisk sykdom. Det er derfor viktig å evaluere effekten av anti-kreftbehandlinger i relevante in vivo-modeller som virkelig rekapitulerer de viktigste molekylære egenskapene til human kreftmetastase. Vi har etablert en ortotopisk modell basert på injeksjon av CRC-pasientavledede kreftceller direkte inn i cecumveggen hos mus. Disse tumorcellene utvikler primære svulster i cecum som metastaserer til leveren og lungene, noe som ofte observeres hos pasienter med avansert CRC. Denne CRC-musemodellen kan brukes til å evaluere legemiddelresponser overvåket av mikrocomputertomografi (μCT), en klinisk relevant småskala bildebehandlingsmetode som lett kan identifisere primære svulster eller metastaser hos pasienter. Her beskriver vi den kirurgiske prosedyren og den nødvendige metodikken for å implantere pasientavledede kreftceller i cecumveggen hos immundefekte mus.
Introduction
Kolorektal kreft (CRC) er den nest største årsaken til kreftdød over hele verden1. Evnen til å generere in vitro eller in vivo tumormodeller avledet fra individuelle pasienttumorceller har avansert presisjonsmedisin innen onkologi. I løpet av det siste tiåret har pasientavledede organoider (PUD) eller xenotransplantater (PDX) blitt brukt av mange forskningsgrupper rundt om i verden2. PUD er flercellede in vitro-strukturer som ligner funksjonene i det opprinnelige tumorvevet og kan selvorganisere og selvfornye3. Disse lovende in vitro-modellene kan med hell brukes til narkotikascreening og legge til rette for translasjonsforskning. På den andre siden rekapitulerer PDX-modellene trofast den opprinnelige CRC på alle relevante nivåer, fra histologi til molekylære egenskaper og legemiddelrespons 2,4.
In vivo PDX-modeller dyrkes for det meste som subkutane svulster i immundefekte mus. Ved hjelp av denne tilnærmingen har PDX blitt gullstandarden i kreftforskning, spesielt for å studere legemiddelfølsomhet eller resistens. Imidlertid er CRC-relaterte dødsfall hovedsakelig forbundet med tilstedeværelsen av metastaserende lesjoner i leveren, lungen eller bukhulen, og ingen av de to tilnærmingene (PUD eller PDX) kan rekapitulere den avanserte kliniske innstillingen. I tillegg har det spesifikke stedet for tumorvekst vist seg å bestemme viktige biologiske egenskaper som har innvirkning på legemiddeleffekt og sykdomsprognose2. Derfor er det et presserende behov for å etablere prekliniske modeller som kan brukes til å vurdere effekten av kreftmedisiner i en klinisk relevant metastatisk setting6.
Mikrocomputertomografiskannere (μCT) kan fungere som nedskalerte kliniske CT-skannere, og gir primærtumor- og metastaseavbildning hos mus med en skalert bildeoppløsning proporsjonal med CT-bilder av kreftpasienter7. For å motvirke den dårlige bløtvevskontrasten til μCT-teknikken, kan radiologiske joderte kontrastmidler brukes til å forbedre kontrasten og evaluere tumorbelastningen. Ved hjelp av en dobbel kontrasttilnærming administreres oralt og intraperitonealt jod på forskjellige tidspunkter. Kontrasten administrert oralt bidrar til å definere grensene mellom tumorvev og cecum innhold inne i tarmen. På den andre siden tillater kontrasten administrert intraperitonealt identifisering av de ytre grensene for tumormassen, som ofte vokser og invaderer bukhinnen8.
Manuskriptet beskriver en protokoll for å utføre ortotopisk implantasjon av pasientavledede kreftceller i cecumveggen hos immundefekte mus, og metodikken for å overvåke intestinal tumorvekst ved hjelp av μCT-skanning. Det foreliggende manuskriptet viser at modellen rekapitulerer det kliniske scenariet med avanserte tarmsvulster og metastatisk sykdom hos CRC-pasienter som ikke kan studeres ved hjelp av PUD- eller PDXO-modeller. Siden ortotopiske PDX-modeller av CRC rekapitulerer det kliniske scenariet for CRC-pasienter, konkluderer vi med at de er de beste til dags dato for å teste effekten av antitumorale legemidler i avanserte tarmtumorer og metastatisk sykdom.
Protocol
Representative Results
Discussion
I løpet av de siste tiårene har mange nye anti-kreftbehandlinger blitt utviklet og testet hos pasienter med forskjellige svulsttyper, inkludert kolorektal kreft (CRC). Selv om lovende resultater i prekliniske modeller har blitt observert i mange tilfeller, har den terapeutiske effekten hos pasienter med avansert metastatisk CRC ofte vært begrenset. Derfor er det et presserende behov for prekliniske modeller som gjør det mulig å teste effekten av nye terapeutiske legemidler i et klinisk relevant metastatisk scenario….
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi anerkjenner Cellex Foundation, CIBERONC-nettverket og Instituto de Salud Carlos III for deres støtte. Videre takker vi også den prekliniske bildebehandlingsplattformen ved Vall d’Hebron Research Institute (VHIR), hvor eksperimentene ble utført.
Materials
| REAGENT | |||
| Apo-Transferrin | MERCK LIFE SCIENCE S.L.U. | T1147-500MG | |
| B27 Supplement | Life Technologies S.A (Spain) | 17504044 | |
| Chlorhexidine Aqueous Solution 2% | DH MATERIAL MÉDICO, S.L. | 1111696250 | |
| Collagenase | MERCK LIFE SCIENCE S.L.U. | C0130-500MG | |
| D-(+)-Glucose | MERCK LIFE SCIENCE S.L.U. | G6152 | |
| DMEM /F12 | LIFE TECHNOLOGIES S.A. | 21331-020 | |
| DNase I | MERCK LIFE SCIENCE S.L.U. | D4263-5VL | |
| EGF | PEPRO TECH EC LTD. | AF-100-15-500 µg | |
| FGF basic | PEPRO TECH EC LTD. | 100-18B | |
| Fungizone | Life Technologies S.A (Spain) | 15290026 | |
| Gentamycin | LIFE TECHNOLOGIES S.A. | 15750037 | |
| Heparin Sodium Salt | MERCK LIFE SCIENCE S.L.U. | H4784-250MG | |
| Insulin | MERCK LIFE SCIENCE S.L.U. | I9278-5ML | |
| Iopamiro | |||
| Isoflurane | – | – | |
| Kanamycin | LIFE TECHNOLOGIES S.A. | 15160047 | |
| L-Glutamine | LIFE TECHNOLOGIES S.A. | 25030032 | |
| Matrigel Matrix | CULTEK, S.L.U. | 356235/356234/354234 | |
| Metacam, 5 mg/mL | – | – | |
| Non-essential amino acids | LIFE TECHNOLOGIES S.A. | 11140035 | |
| Nystatin | MERCK LIFE SCIENCE S.L.U. | N4014-50MG | |
| Pen/Strep | Life Technologies S.A (Spain) | 15140122 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS), sterile | Labclinics S.A | L0615-500 | |
| Progesterone | MERCK LIFE SCIENCE S.L.U. | P0130-25G | |
| Putrescine | MERCK LIFE SCIENCE S.L.U. | P5780-5G | |
| RBC Lysis Buffer | Labclinics S.A | 00-4333-57 | |
| Sodium Pyruvate | LIFE TECHNOLOGIES S.A. | 11360039 | |
| Sodium Selenite | MERCK LIFE SCIENCE S.L.U. | S5261-25G | |
| ESSENTIAL SUPPLIES | |||
| 8 weeks-old NOD.CB17-Prkdcscid/NcrCrl mice | – | – | |
| BD Micro-Fine 0.5 ml U 100 needle 0.33 mm (29G) x 12.7 mm | BECTON DICKINSON, S.A.U. | 320926 | |
| Blade #24 | – | – | |
| Cell Strainer 100 µm | Cultek, SLU | 45352360 | |
| Forceps and Surgical scissors | – | – | |
| Heating pad | – | – | |
| Lacryvisc, 3 mg/g, ophthalmic gel | – | – | |
| Surfasafe | – | – | |
| Suture PROLENE 5-0 | JOHNSON&JOHNSON S, A. | 8720H | |
| EQUIPMENT/SOFTWARE | |||
| Quantum FX µCT Imaging system | Perkin Elmer | Perkin Elmer | http://www.perkinelmer.com/es/product/quantum-gx-instrument-120-240-cls140083 |
References
- Sung, H., et al. Global Cancer Statistics 2020: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA: a Cancer Journal for Clinicians. 71 (3), 209-249 (2021).
- Puig, I., et al. A personalized preclinical model to evaluate the metastatic potential of patient-derived colon cancer initiating cells. Clinical Cancer Research. 19 (24), 6787-6801 (2013).
- Clevers, H. Modeling development and disease with organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
- Byrne, A. T., et al. Interrogating open issues in cancer precision medicine with patient-derived xenografts. Nature Reviews. Cancer. 17 (4), 254-268 (2017).
- Vatandoust, S., Price, T. J., Karapetis, C. S. Colorectal cancer: Metastases to a single organ. World Journal of Gastroenterology. 21 (41), 11767-11776 (2015).
- Cespedes, M. V., et al. Orthotopic microinjection of human colon cancer cells in nude mice induces tumor foci in all clinically relevant metastatic sites. The American Journal of Pathology. 170 (3), 1077-1085 (2007).
- Durkee, B. Y., Weichert, J. P., Halberg, R. B. Small animal micro-CT colonography. Methods. 50 (1), 36-41 (2010).
- Boll, H., et al. Double-contrast micro-CT colonoscopy in live mice. International Journal of Colorectal Disease. 26 (6), 721-727 (2011).
- O’Brien, C. A., Pollett, A., Gallinger, S., Dick, J. E. A human colon cancer cell capable of initiating tumour growth in immunodeficient mice. Nature. 445 (7123), 106-110 (2007).
- Jensen, M. M., Jorgensen, J. T., Binderup, T., Kjaer, A. Tumor volume in subcutaneous mouse xenografts measured by microCT is more accurate and reproducible than determined by 18F-FDG-microPET or external caliper. BMC Medical Imaging. 8, 16 (2008).
- Herpers, B., et al. Functional patient-derived organoid screenings identify MCLA-158 as a therapeutic EGFR x LGR5 bispecific antibody with efficacy in epithelial tumors. Nature Cancer. 3 (4), 418-436 (2022).
- Chicote, I., Camara, J. A., Palmer, H. G. Advanced colorectal cancer orthotopic patient-derived xenograft models for cancer and stem cell research. Methods in Molecular Biology. 2171, 321-329 (2020).
