Ortopisk implantation af patientafledte kræftceller hos mus rekapitulerer avanceret kolorektal cancer
Summary
Denne protokol beskriver den ortopiske implantation af patientafledte kræftceller i cecumvæggen hos immundefekte mus. Modellen rekapitulerer avanceret kolorektal cancer metastatisk sygdom og giver mulighed for evaluering af nye terapeutiske lægemidler i et klinisk relevant scenario af lunge- og levermetastaser.
Abstract
I løbet af det sidste årti er der etableret mere sofistikerede prækliniske kolorektal cancer (CRC) modeller ved hjælp af patientafledte kræftceller og 3D-tumoroider. Da patientafledte tumororganoider kan bevare egenskaberne ved den oprindelige tumor, muliggør disse pålidelige prækliniske modeller screening af kræftmedicin og undersøgelse af lægemiddelresistensmekanismer. CRC-relateret død hos patienter er dog for det meste forbundet med tilstedeværelsen af metastatisk sygdom. Det er derfor vigtigt at evaluere effektiviteten af kræftbehandlinger i relevante in vivo-modeller , der virkelig rekapitulerer de vigtigste molekylære træk ved human kræftmetastase. Vi har etableret en ortopisk model baseret på injektion af CRC-patientafledte kræftceller direkte i musenes cecumvæg. Disse tumorceller udvikler primære tumorer i cecum, der metastaserer til leveren og lungerne, hvilket ofte observeres hos patienter med avanceret CRC. Denne CRC-musemodel kan bruges til at evaluere lægemiddelresponser overvåget af mikrocomputertomografi (μCT), en klinisk relevant billeddannelsesmetode i lille skala, der let kan identificere primære tumorer eller metastaser hos patienter. Her beskriver vi det kirurgiske indgreb og den nødvendige metode til at implantere patientafledte kræftceller i cecumvæggen hos mus, der er immundefekte.
Introduction
Kolorektal cancer (CRC) er den næststørste årsag til kræftdødpå verdensplan 1. Evnen til at generere in vitro eller in vivo tumormodeller afledt af individuelle patienttumorceller har avanceret præcisionsmedicin inden for onkologi. I løbet af det sidste årti er patientafledte organoider (PDO’er) eller xenotransplantater (PDX’er) blevet brugt af mange forskergrupper rundt om i verden2. BDO’er er multicellulære in vitro-strukturer, der ligner funktionerne i det oprindelige tumorvæv og kan selvorganisere og fornysig selv 3. Disse lovende in vitro-modeller kan med succes anvendes til lægemiddelscreening og til fremme af translationel forskning. På den anden side rekapitulerer PDX-modeller trofast den originale CRC på alle relevante niveauer, fra histologi til molekylære træk og lægemiddelrespons 2,4.
In vivo PDX-modeller dyrkes for det meste som subkutane tumorer i immundefekte mus. Ved hjælp af denne tilgang er PDX’er blevet guldstandarden inden for kræftforskning, især til at studere lægemiddelfølsomhed eller resistens. Imidlertid er CRC-relaterede dødsfald for det meste forbundet med tilstedeværelsen af metastatiske læsioner i leveren, lungen eller bughulen, og ingen af de to tilgange (BOB eller PDX) kan rekapitulere den avancerede kliniske indstilling. Derudover har det specifikke sted for tumorvækst vist sig at bestemme vigtige biologiske egenskaber, der har indflydelse på lægemiddeleffektivitet og sygdomsprognose2. Der er derfor et presserende behov for at etablere prækliniske modeller, der kan anvendes til at vurdere effekten af kræftlægemidler i en klinisk relevant metastatisk indstilling6.
Mikrocomputertomografi (μCT) scannere kan fungere som nedskalerede kliniske CT-scannere, der giver primær tumor- og metastasebilleddannelse hos mus ved en skaleret billedopløsning, der er proportional med CT-billeder af kræftpatienter7. For at modvirke den dårlige bløddelskontrast i μCT-teknikken kan radiologiske jodholdige kontrastmidler anvendes til at forbedre kontrasten og evaluere tumorbyrden. Ved hjælp af en dobbelt kontrast tilgang, oral og intraperitoneal jod administreres på forskellige tidspunkter. Kontrasten administreret oralt hjælper med at definere grænserne mellem tumorvæv og cecumindhold inde i tarmen. På den anden side tillader kontrasten administreret intraperitonealt identifikation af de ydre grænser for tumormassen, som ofte vokser og invaderer peritoneum8.
Manuskriptet beskriver en protokol til udførelse af ortopisk implantation af patientafledte kræftceller i cecumvæggen hos immundefekte mus og metoden til overvågning af tarmtumorvækst ved hjælp af μCT-scanning. Dette manuskript viser, at modellen rekapitulerer det kliniske scenarie for fremskredne tarmtumorer og metastatisk sygdom hos CRC-patienter, som ikke kan studeres ved hjælp af BOB- eller PDXO-modeller. Da ortopiske PDX-modeller af CRC rekapitulerer det kliniske scenario for CRC-patienter, konkluderer vi, at de er de bedste til dato til at teste effekten af antitumorale lægemidler i avancerede tarmtumorer og metastatisk sygdom.
Protocol
Representative Results
Discussion
I løbet af de sidste par årtier er mange nye kræftbehandlinger blevet udviklet og testet hos patienter med forskellige tumortyper, herunder kolorektal cancer (CRC). Selvom lovende resultater i prækliniske modeller er blevet observeret i mange tilfælde, har den terapeutiske effekt hos patienter med avanceret metastatisk CRC ofte været begrænset. Derfor er der et presserende behov for prækliniske modeller, der gør det muligt at teste effekten af nye terapeutiske lægemidler i et klinisk relevant metastatisk scenar…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi anerkender Cellex Foundation, CIBERONC-netværket og Instituto de Salud Carlos III for deres støtte. Desuden takker vi også den prækliniske billeddannelsesplatform på Vall d’Hebron Research Institute (VHIR), hvor eksperimenterne blev udført.
Materials
| REAGENT | |||
| Apo-Transferrin | MERCK LIFE SCIENCE S.L.U. | T1147-500MG | |
| B27 Supplement | Life Technologies S.A (Spain) | 17504044 | |
| Chlorhexidine Aqueous Solution 2% | DH MATERIAL MÉDICO, S.L. | 1111696250 | |
| Collagenase | MERCK LIFE SCIENCE S.L.U. | C0130-500MG | |
| D-(+)-Glucose | MERCK LIFE SCIENCE S.L.U. | G6152 | |
| DMEM /F12 | LIFE TECHNOLOGIES S.A. | 21331-020 | |
| DNase I | MERCK LIFE SCIENCE S.L.U. | D4263-5VL | |
| EGF | PEPRO TECH EC LTD. | AF-100-15-500 µg | |
| FGF basic | PEPRO TECH EC LTD. | 100-18B | |
| Fungizone | Life Technologies S.A (Spain) | 15290026 | |
| Gentamycin | LIFE TECHNOLOGIES S.A. | 15750037 | |
| Heparin Sodium Salt | MERCK LIFE SCIENCE S.L.U. | H4784-250MG | |
| Insulin | MERCK LIFE SCIENCE S.L.U. | I9278-5ML | |
| Iopamiro | |||
| Isoflurane | – | – | |
| Kanamycin | LIFE TECHNOLOGIES S.A. | 15160047 | |
| L-Glutamine | LIFE TECHNOLOGIES S.A. | 25030032 | |
| Matrigel Matrix | CULTEK, S.L.U. | 356235/356234/354234 | |
| Metacam, 5 mg/mL | – | – | |
| Non-essential amino acids | LIFE TECHNOLOGIES S.A. | 11140035 | |
| Nystatin | MERCK LIFE SCIENCE S.L.U. | N4014-50MG | |
| Pen/Strep | Life Technologies S.A (Spain) | 15140122 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS), sterile | Labclinics S.A | L0615-500 | |
| Progesterone | MERCK LIFE SCIENCE S.L.U. | P0130-25G | |
| Putrescine | MERCK LIFE SCIENCE S.L.U. | P5780-5G | |
| RBC Lysis Buffer | Labclinics S.A | 00-4333-57 | |
| Sodium Pyruvate | LIFE TECHNOLOGIES S.A. | 11360039 | |
| Sodium Selenite | MERCK LIFE SCIENCE S.L.U. | S5261-25G | |
| ESSENTIAL SUPPLIES | |||
| 8 weeks-old NOD.CB17-Prkdcscid/NcrCrl mice | – | – | |
| BD Micro-Fine 0.5 ml U 100 needle 0.33 mm (29G) x 12.7 mm | BECTON DICKINSON, S.A.U. | 320926 | |
| Blade #24 | – | – | |
| Cell Strainer 100 µm | Cultek, SLU | 45352360 | |
| Forceps and Surgical scissors | – | – | |
| Heating pad | – | – | |
| Lacryvisc, 3 mg/g, ophthalmic gel | – | – | |
| Surfasafe | – | – | |
| Suture PROLENE 5-0 | JOHNSON&JOHNSON S, A. | 8720H | |
| EQUIPMENT/SOFTWARE | |||
| Quantum FX µCT Imaging system | Perkin Elmer | Perkin Elmer | http://www.perkinelmer.com/es/product/quantum-gx-instrument-120-240-cls140083 |
References
- Sung, H., et al. Global Cancer Statistics 2020: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA: a Cancer Journal for Clinicians. 71 (3), 209-249 (2021).
- Puig, I., et al. A personalized preclinical model to evaluate the metastatic potential of patient-derived colon cancer initiating cells. Clinical Cancer Research. 19 (24), 6787-6801 (2013).
- Clevers, H. Modeling development and disease with organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
- Byrne, A. T., et al. Interrogating open issues in cancer precision medicine with patient-derived xenografts. Nature Reviews. Cancer. 17 (4), 254-268 (2017).
- Vatandoust, S., Price, T. J., Karapetis, C. S. Colorectal cancer: Metastases to a single organ. World Journal of Gastroenterology. 21 (41), 11767-11776 (2015).
- Cespedes, M. V., et al. Orthotopic microinjection of human colon cancer cells in nude mice induces tumor foci in all clinically relevant metastatic sites. The American Journal of Pathology. 170 (3), 1077-1085 (2007).
- Durkee, B. Y., Weichert, J. P., Halberg, R. B. Small animal micro-CT colonography. Methods. 50 (1), 36-41 (2010).
- Boll, H., et al. Double-contrast micro-CT colonoscopy in live mice. International Journal of Colorectal Disease. 26 (6), 721-727 (2011).
- O’Brien, C. A., Pollett, A., Gallinger, S., Dick, J. E. A human colon cancer cell capable of initiating tumour growth in immunodeficient mice. Nature. 445 (7123), 106-110 (2007).
- Jensen, M. M., Jorgensen, J. T., Binderup, T., Kjaer, A. Tumor volume in subcutaneous mouse xenografts measured by microCT is more accurate and reproducible than determined by 18F-FDG-microPET or external caliper. BMC Medical Imaging. 8, 16 (2008).
- Herpers, B., et al. Functional patient-derived organoid screenings identify MCLA-158 as a therapeutic EGFR x LGR5 bispecific antibody with efficacy in epithelial tumors. Nature Cancer. 3 (4), 418-436 (2022).
- Chicote, I., Camara, J. A., Palmer, H. G. Advanced colorectal cancer orthotopic patient-derived xenograft models for cancer and stem cell research. Methods in Molecular Biology. 2171, 321-329 (2020).
