שיטת הומוגניזציה מהירה, פשוטה וסטנדרטית להכנת אמולסיות אנטיגן/אדג'ובנטיות לגרימת אנצפלומיאליטיס אוטואימונית ניסיונית
Summary
כדי לגרום לאנצפלומיאליטיס אוטואימונית ניסיונית, מודל חייתי של טרשת נפוצה, עכברים מחוסנים בתחליב מים בשמן המכיל אוטואנטיגן ואדג’ובנט שלם של פרוינד. בעוד שקיימים מספר פרוטוקולים להכנת אמולסיות אלה, מוצג כאן פרוטוקול הומוגניזציה מהיר, פשוט וסטנדרטי להכנת אמולסיה.
Abstract
אנצפלומיאליטיס אוטואימונית ניסיונית (EAE) חולקת מאפיינים אימונולוגיים וקליניים דומים עם טרשת נפוצה (MS), ולכן נעשה בה שימוש נרחב כמודל לזיהוי מטרות תרופות חדשות לטיפול טוב יותר בחולים. טרשת נפוצה מאופיינת במספר מסלולי מחלה שונים: טרשת נפוצה חוזרת (RRMS), טרשת נפוצה פרוגרסיבית ראשונית (PPMS), טרשת נפוצה פרוגרסיבית משנית (SPMS), וצורה נדירה של טרשת נפוצה מתקדמת (PRMS). למרות שמודלים של בעלי חיים אינם מחקים במדויק את כל הפנוטיפים המנוגדים הללו של מחלות אנושיות, ישנם מודלים של EAE המשקפים חלק מהביטויים הקליניים השונים של טרשת נפוצה. לדוגמה, EAE המושרה על-ידי מיאלין אוליגודנדרוציטים גליקופרוטאין (MOG) בעכברי C57BL/6J מחקה PPMS אנושי, בעוד ש-EAE המושרה על-ידי חלבון פרוטאוליפיד מיאלין (PLP) בעכברי SJL/J דומה ל-RRMS. נוגדי חמצון עצמיים אחרים, כגון חלבון בסיסי מיאלין (MBP), ומספר זנים שונים של עכברים משמשים גם הם לחקר EAE. כדי לגרום למחלה במודלים אלה של חיסון נגד אנטיגנים עצמיים, מכינים ומזריקים תחליב מים בשמן באופן תת-עורי. רוב המודלים של EAE דורשים גם הזרקה של רעלן שעלת כדי שהמחלה תתפתח. להשראת EAE עקבית וניתנת לשחזור, יש צורך בפרוטוקול מפורט להכנת הריאגנטים לייצור תחליבי אנטיגן/אדג’ובנטיים. השיטה המתוארת כאן מנצלת שיטה סטנדרטית ליצירת תחליבי מים בשמן. הוא פשוט ומהיר ומשתמש בהומוגנייזר מטלטל במקום במזרקים להכנת תחליבים מבוקרי איכות.
Introduction
התמוטטות של סובלנות חיסונית יכולה לגרום ליצירת הפרעות אוטואימוניות, כגון טרשת נפוצה (MS). ההערכה היא כי 2.8 מיליון אנשים חיים עם טרשת נפוצה ברחבי העולם1. למרות שהסיבה המדויקת לטרשת נפוצה עדיין אינה ידועה במידה רבה, חוסר ויסות של תאי T ו- B תגובתיים אוטומטיים, כמו גם פגמים בתפקוד Treg, ממלאים תפקידים חשובים בפתוגנזה של המחלה 2,3.
מודלים חייתיים של מחלות אוטואימוניות הם כלים חיוניים לחקר שיטות טיפוליות פוטנציאליות. המודל הניסיוני של אנצפלומיאליטיס אוטואימונית (EAE) נמצא בשימוש כבר כמעט מאה שנה על ידי חוקרים המתעניינים בטרשת נפוצה4. בניסויים מוקדמים, שכיחות המחלה הייתה נמוכה יחסית. הכנסת האדג’ובנט השלם של פרוינד (CFA), המכיל מיקובקטריום ורעלן שעלת, אפשרה השראה עקבית של EAE בעכברים4. והכי חשוב, יש צורך לערבב CFA עם אנטיגן ספציפי למערכת העצבים המרכזית (CNS) כדי ליצור תחליב מים הומוגני בשמן לגרימת EAE. המודלים הנפוצים ביותר של EAE הזמינים כיום מבוססים על חיסון פעיל של עכברים עם פפטידים אנצפליטוגניים. הרקע הגנטי של העכברים ממלא תפקיד חשוב ברגישות למחלות, כאשר גליקופרוטאין מיאלין אוליגודנדרוציטים (MOG35-55) וחלבון פרוטאוליפיד מיאלין (PLP139-151) משמשים להשראת EAE בעכברי C57BL/6J ו-SJL, בהתאמה5. עם זאת, ניתן להשתמש גם בזני עכברים אחרים ובפפטידים שמקורם במערכת העצבים המרכזית.
האיכות של תחליב CFA/פפטיד היא גורם קריטי שקובע את חדירות המחלה בחיסון הפעיל EAE מודל6. יש להכין תחליב מים הומוגני בשמן על ידי ערבוב הפפטידים האנצפליטוגניים המומסים בחיץ מימי עם CFA, אחרת בעלי חיים לא יפתחו את המחלה. פרוטוקולים רבים פורסמו על הכנת תחליבי CFA/פפטידים. דוגמאות כוללות שימוש במערבולת7, סוניקציה8, מזרקים ומחבר T תלת-כיווני9, או מזרק אחד בלבד5. עם זאת, כל השיטות הללו קשות לסטנדרטיזציה ולעתים קרובות קשורות לפרוטוקולים ארוכים ומסובכים.
בהשוואה לכל השיטות הנ”ל, השיטה הפשוטה המתוארת כאן להכנת תחליב מציעה את היתרונות של היעדר הבדלים בין אדם לאדם והיותה מהירה יחסית. האמולסיה נוצרת על ידי הומוגנייזר שמטלטל את הריאגנטים במהירות, זמן וטמפרטורה מוגדרים, מה שמבטיח תוצאות מהירות ועקביות. בנוסף לגרימת מחלות במודל EAE, שיטה זו יכולה לשמש גם לחקר מודלים אחרים של מחלות אוטואימוניות כגון דלקת מפרקים הנגרמת על ידי קולגן (CIA) ודלקת מפרקים הנגרמת על ידי אנטיגן (AIA)6. לכן, צפוי כי שיטה זו יכולה לשמש כדי לגרום באופן עקבי למחלות במודלים אחרים של בעלי חיים התלויים בתחליבי מים בשמן עם אנטיגנים עצמיים, כגון דלקת עצבים אוטואימונית ניסיונית (EAN)10, דלקת אוטואימונית ניסיונית של בלוטת התריס (EAT)11, אובאיטיס אוטואימונית (EAU)12, ומיאסטניה גרביס (MG)13. שיטה זו גם גורמת לתגובות חיסוניות כלליות כגון רגישות יתר מסוג מושהה (DTH) באופן עקבי6, ולכן יכולה לשמש להעברת חיסונים נגד סרטן ומלריה (ראו דיון).
לפיכך, פותחה שיטה מהירה (זמן הכנה כולל ~ 30 דקות), פשוטה (ניתן להכין את כל הריאגנטים מראש ולאחסן אותה), וסטנדרטית (התחליב מתבצע באמצעות הומוגנייזר מטלטל) ומוצגת כאן. תחליבי CFA/אנטיגן שהוכנו באמצעות פרוטוקול זה גורמים באופן עקבי למחלות במודלים אוטואימוניים של בעלי חיים.
Protocol
Representative Results
Discussion
תחליבי מים בשמן, כגון אדג’ובנט של אנטיגן/פרוינד, שימשו במשך יותר מחצי מאה להשראת EAE17. אין כיום שיטה סטנדרטית להכנת תחליבי אנטיגן שאינם תלויים בהשפעת האדם. ערבוב ידני באמצעות מזרקים הוא סטנדרטי עבור רוב המעבדות, אולם שיטה זו היא זמן רב, לעתים קרובות גורם לאובדן מוגזם של חומר, ואת …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחבר מבקש להודות ליחידות הדיור לבעלי חיים באוניברסיטת לונד, קמילה ביורקלוב ואגניישקה צ’ופק, על תמיכתן, ולריצ’רד ויליאמס, מכון קנדי לראומטולוגיה, אוניברסיטת אוקספורד, בריטניה, על ביקורת בונה ותמיכה לשונית בהפקת כתב יד זה.
Materials
| 1 mL Injection syringe | B. Braun | 9166017V | |
| 1 mL Injection syringe | Sigma-Aldrich | Z683531 | |
| 7 ml empty tubes with caps | Bertin-Instruments | P000944LYSK0A.0 | 7 mL tube |
| 50 mL sterile centrifuge tube | Fisher Scientific | 10788561 | 50 mL tube |
| Bordetella pertussis toxin | Sigma-Aldrich | P2980 | Store at -20 °C |
| Dispersant, light mineral oil | Sigma-Aldrich | M8410 | Store at RT |
| Emulsion kit | Bertin-Instruments | D34200.10 ea | Containing a tube, cap, and plunger |
| Incomplete Freund's Adjuvant | Sigma-Aldrich | F5506 | Store at +4 °C |
| Mycobacterium tuberculosis, H37RA | Fisher Scientific | DF3114-33-8 | Store at +4 °C |
| Mastersizer 2000 | Malvern Panalytical | N/A | Particle size analyzer |
| Minilys-Personal homogenizer | Bertin-Instruments | P000673-MLYS0-A | Shaking homogenizer |
| MOG 35-55 Peptide | Innovagen | N/A | |
| Montanide ISA 51 VG | Seppic | 36362Z | FDA-approved oil adjuvant |
| Pall Acrodisc Syringe Filters 0.2 μm | Fisher Scientific | 17124381 | Sterlie filter |
| PBS, Ca2+/Mg2+ free | Thermo Fisher Scientific | 14190144 | PBS |
| Phase-Constrast Microscope | Olympus | BX40-B | |
| Steel Beads 3.2 mm | Fisher Scientific | NC0445832 | Autoclave and store at RT |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 648463 | Store at RT |
References
- Walton, C., et al. Rising prevalence of multiple sclerosis worldwide: Insights from the Atlas of MS, third edition. Multiple Sclerosis. 26 (14), 1816-1821 (2020).
- van Langelaar, J., Rijvers, L., Smolders, J., van Luijn, M. M. B and T cells driving multiple sclerosis: identity, mechanisms and potential triggers. Frontiers in Immunology. 11, 760 (2020).
- Sambucci, M., Gargano, F., Guerrera, G., Battistini, L., Borsellino, G. One, No One, and One Hundred Thousand: T Regulatory Cells’ Multiple Identities in Neuroimmunity. Frontiers in Immunology. 10, 2947 (2019).
- Mix, E., Meyer-Rienecker, H., Hartung, H. P., Zettl, U. K. Animal models of multiple sclerosis–potentials and limitations. Progress in Neurobiology. 92 (3), 386-404 (2010).
- Terry, R. L., Ifergan, I., Miller, S. D. Experimental Autoimmune Encephalomyelitis in Mice. Methods in Molecular Biology. 1304, 145-160 (2016).
- Topping, L. M., et al. Standardization of antigen-emulsion preparations for the induction of autoimmune disease models. Frontiers in Immunology. 13, 892251 (2022).
- Flies, D. B., Chen, L. A simple and rapid vortex method for preparing antigen/adjuvant emulsions for immunization. Journal of Immunological Methods. 276 (1-2), 239-242 (2003).
- Määttä, J. A., Erälinna, J. P., Röyttä, M., Salmi, A. A., Hinkkanen, A. E. Physical state of the neuroantigen in adjuvant emulsions determines encephalitogenic status in the BALB/c mouse. Journal of Immunological Methods. 190 (1), 133-141 (1996).
- Moncada, C., Torres, V., Israel, Y. Simple method for the preparation of antigen emulsions for immunization. Journal of Immunological Methods. 162 (1), 133-140 (1993).
- Waksman, B. H., Adams, R. D. Allergic neuritis: an experimental disease of rabbits induced by the injection of peripheral nervous tissue and adjuvants. The Journal of Experimental Medicine. 102 (2), 213-236 (1955).
- Vladutiu, A. O., Rose, N. R. Autoimmune murine thyroiditis relation to histocompatibility (H-2) type. Science. 174 (4014), 1137-1139 (1971).
- Caspi, R. R. Experimental autoimmune uveoretinitis in the rat and mouse. Current Protocols in Immunology. , (2003).
- Tuzun, E., et al. Guidelines for standard preclinical experiments in the mouse model of myasthenia gravis induced by acetylcholine receptor immunization. Experimental Neurology. 270, 11-17 (2015).
- Brinckerhoff, L. H., et al. Terminal modifications inhibit proteolytic degradation of an immunogenic MART-1(27-35) peptide: implications for peptide vaccines. International Journal of Cancer. 83 (3), 326-334 (1999).
- Kool, M., et al. Alum adjuvant boosts adaptive immunity by inducing uric acid and activating inflammatory dendritic cells. The Journal of Experimental Medicine. 205 (4), 869-882 (2008).
- Hasselmann, J. P. C., Karim, H., Khalaj, A. J., Ghosh, S., Tiwari-Woodruff, S. K. Consistent induction of chronic experimental autoimmune encephalomyelitis in C57BL/6 mice for the longitudinal study of pathology and repair. Journal of Neuroscience Methods. 284, 71-84 (2017).
- Freund, J., Lipton, M. M. Experimental allergic encephalomyelitis after the excision of the injection site of antigen-adjuvant emulsion. The Journal of Immunology. 75 (6), 454-459 (1955).
- Stromnes, I. M., Goverman, J. M. Active induction of experimental allergic encephalomyelitis. Nature Protocols. 1 (4), 1810-1819 (2006).
- Shaw, M. K., Zhao, X. Q., Tse, H. Y. Overcoming unresponsiveness in experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) resistant mouse strains by adoptive transfer and antigenic challenge. Journal of Visualized Experiments. (62), e3778 (2012).
- Arevalo-Herrera, M., et al. Randomized clinical trial to assess the protective efficacy of a Plasmodium vivax CS synthetic vaccine. Nature Communications. 13 (1), 1603 (2022).
- Jiang, C., et al. Potential association factors for developing effective peptide-based cancer vaccines. Frontiers in Immunology. 13, 931612 (2022).
- Neninger Vinageras, E., et al. Phase II randomized controlled trial of an epidermal growth factor vaccine in advanced non-small-cell lung cancer. Journal of Clinical Oncology. 26 (9), 1452-1458 (2008).
