Deneysel Otoimmün Ensefalomiyeliti İndüklemek için Antijen/Adjuvan Emülsiyonlar Hazırlamak için Hızlı, Basit ve Standartlaştırılmış Bir Homojenizasyon Yöntemi
Summary
Multipl sklerozun bir hayvan modeli olan deneysel otoimmün ensefalomiyeliti indüklemek için, fareler bir otoantijen ve Freund’un adjuvanını tamamlayan bir yağda su emülsiyonu ile bağışıklanır. Bu emülsiyonların hazırlanması için çeşitli protokoller mevcut olsa da, emülsiyon hazırlığı için hızlı, basit ve standartlaştırılmış bir homojenizasyon protokolü burada sunulmaktadır.
Abstract
Deneysel otoimmün ensefalomiyelit (EAE), multipl skleroz (MS) ile benzer immünolojik ve klinik özellikleri paylaşır ve bu nedenle daha iyi hasta tedavisi için yeni ilaç hedeflerini belirlemek için bir model olarak yaygın olarak kullanılır. MS birkaç farklı hastalık seyri ile karakterizedir: relapsing-remitting MS (RRMS), primer progresif MS (PPMS), sekonder progresif MS (SPMS) ve nadir görülen progresif relaps MS formu (PRMS). Hayvan modelleri, bu zıt insan hastalığı fenotiplerinin tümünü doğru bir şekilde taklit etmese de, MS’in farklı klinik belirtilerinden bazılarını yansıtan EAE modelleri vardır. Örneğin, C57BL / 6J farelerinde miyelin oligodendrosit glikoprotein (MOG) ile indüklenen EAE, insan PPMS’sini taklit ederken, SJL / J farelerde miyelin proteolipid proteini (PLP) ile indüklenen EAE, RRMS’ye benzer. Miyelin bazik proteini (MBP) ve bir dizi farklı fare suşu gibi diğer otoantijenler de EAE’yi incelemek için kullanılır. Bu otoantijen immünizasyonu EAE modellerinde hastalığı indüklemek için, bir yağda su emülsiyonu hazırlanır ve deri altından enjekte edilir. EAE modellerinin çoğu, hastalığın gelişmesi için boğmaca toksini enjeksiyonu gerektirir. Tutarlı ve tekrarlanabilir EAE indüksiyonu için, reaktifleri antijen / adjuvan emülsiyonları üretmeye hazırlamak için ayrıntılı bir protokol gereklidir. Burada açıklanan yöntem, yağda su emülsiyonları üretmek için standartlaştırılmış bir yöntemden yararlanır. Basit ve hızlıdır ve kalite kontrollü emülsiyonlar hazırlamak için şırıngalar yerine sallanan bir homojenizatör kullanır.
Introduction
İmmünolojik toleransın bozulması, multipl skleroz (MS) gibi otoimmün bozuklukların oluşmasına neden olabilir. Dünya çapında 2,8 milyon kişinin MS ile yaşadığı tahmin edilmektedir1. MS’in kesin nedeni hala büyük ölçüde bilinmemekle birlikte, otoreaktif T ve B hücrelerinin düzensizliği ve Treg fonksiyonundaki defektler hastalığın patogenezinde önemli rol oynamaktadır 2,3.
Otoimmün hastalıkların hayvan modelleri, potansiyel terapötik modaliteleri araştırmak için gerekli araçlardır. Deneysel otoimmün ensefalomiyelit (EAE) modeli, MS4 ile ilgilenen araştırmacılar tarafından neredeyse bir asırdır kullanılmaktadır. İlk deneylerde, hastalığın insidansı nispeten düşüktü. Mycobacterium ve boğmaca toksini içeren tam Freund adjuvanının (CFA) tanıtılması, farelerde EAE’nin tutarlı bir şekilde indüklenmesini sağladı4. En önemlisi, EAE’yi indüklemek için homojen bir yağda su emülsiyonu oluşturmak için CFA’yı merkezi sinir sistemine (CNS) özgü bir antijenle karıştırmak gerekir. Şu anda mevcut olan en yaygın EAE modelleri, farelerin ensefalitojenik peptitlerle aktif bağışıklanmasına dayanmaktadır. Farelerin genetik arka planı, sırasıyla C57BL / 6J ve SJL farelerde EAE’yi indüklemek için kullanılan miyelin oligodendrosit glikoprotein (MOG35-55) ve miyelin proteolipid proteini (PLP139-151) peptidleri ile hastalık duyarlılığında önemli bir rol oynamaktadır5. Bununla birlikte, diğer fare suşları ve CNS türevi peptitler de kullanılabilir.
CFA / peptid emülsiyonunun kalitesi, aktif immünizasyon EAE model6’da hastalık penetransını belirleyen kritik bir faktördür. Sulu tamponda çözünmüş ensefalojenik peptitlerin CFA ile karıştırılmasıyla homojen bir yağda su emülsiyonu hazırlanmalıdır, aksi takdirde hayvanlar hastalığı geliştirmez. CFA / peptid emülsiyonlarının hazırlanması konusunda çok sayıda protokol yayınlanmıştır. Örnekler arasında vorteks7, sonication8, şırıngalar ve üç yönlü bir T konektörü9 veya sadece bir şırınga5 kullanımı bulunur. Bununla birlikte, tüm bu yöntemlerin standartlaştırılması zordur ve genellikle uzun ve karmaşık protokollerle ilişkilidir.
Yukarıdaki tüm yöntemlerle karşılaştırıldığında, emülsiyon hazırlığı için burada açıklanan basit yöntem, kişiden kişiye farklılık göstermemenin ve nispeten hızlı olmanın avantajlarını sunar. Emülsiyon, reaktifleri belirli bir hız, zaman ve sıcaklıkla çalkalayan ve hızlı ve tutarlı sonuçlar sağlayan bir homojenizatör tarafından üretilir. EAE modelinde hastalığı indüklemenin yanı sıra, bu yöntem kollajen kaynaklı artrit (CIA) ve antijen kaynaklı artrit (AIA) gibi diğer otoimmün hastalık modellerini incelemek için de kullanılabilir6. Bu nedenle, bu yöntemin, deneysel otoimmün nörit (EAN)10, deneysel otoimmün tiroidit (EAT)11, otoimmün üveit (EAU)12 ve myastenia gravis (MG)13 gibi otoantijenlerle yağda su emülsiyonlarına bağlı diğer hayvan modellerinde sürekli olarak hastalığı indüklemek için kullanılabileceği tahmin edilmektedir. Bu yöntem aynı zamanda gecikmiş tip aşırı duyarlılık (DTH) gibi genel bağışıklık tepkilerini sürekli olarak6 indükler ve bu nedenle kanser ve sıtma aşıları sunmak için kullanılabilir (tartışmaya bakınız).
Böylece, hızlı (toplam hazırlama süresi ~ 30 dakika), basit (tüm reaktifler önceden hazırlanabilir ve saklanabilir) ve standartlaştırılmış (emülsiyon bir sallama homojenizatörü kullanılarak gerçekleştirilir) bir yöntem geliştirilmiş ve burada sunulmuştur. Bu protokol kullanılarak hazırlanan CFA / antijen emülsiyonları, otoimmün hayvan modellerinde sürekli olarak hastalığı indüklemektedir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Antijen / Freund adjuvanı gibi yağda su emülsiyonları, EAE17’yi indüklemek için yarım yüzyıldan fazla bir süredir kullanılmaktadır. Şu anda insan etkisinden bağımsız antijen emülsiyonları hazırlamak için standartlaştırılmış bir yöntem yoktur. Şırıngalar kullanarak manuel karıştırma çoğu laboratuvar için standarttır, ancak bu yöntem zaman alıcıdır, genellikle aşırı malzeme kaybına neden olur ve kalite, onu hazırlayan bilim adamına bağlı olarak değiş…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazar, Lund Üniversitesi, Camilla Björklöv ve Agnieszka Czopek’teki hayvan barınma birimlerine destekleri için ve Richard Williams, Kennedy Romatoloji Enstitüsü, Oxford Üniversitesi, İngiltere, bu makaleyi üreten yapıcı eleştiri ve dilbilimsel destek için teşekkür eder.
Materials
| 1 mL Injection syringe | B. Braun | 9166017V | |
| 1 mL Injection syringe | Sigma-Aldrich | Z683531 | |
| 7 ml empty tubes with caps | Bertin-Instruments | P000944LYSK0A.0 | 7 mL tube |
| 50 mL sterile centrifuge tube | Fisher Scientific | 10788561 | 50 mL tube |
| Bordetella pertussis toxin | Sigma-Aldrich | P2980 | Store at -20 °C |
| Dispersant, light mineral oil | Sigma-Aldrich | M8410 | Store at RT |
| Emulsion kit | Bertin-Instruments | D34200.10 ea | Containing a tube, cap, and plunger |
| Incomplete Freund's Adjuvant | Sigma-Aldrich | F5506 | Store at +4 °C |
| Mycobacterium tuberculosis, H37RA | Fisher Scientific | DF3114-33-8 | Store at +4 °C |
| Mastersizer 2000 | Malvern Panalytical | N/A | Particle size analyzer |
| Minilys-Personal homogenizer | Bertin-Instruments | P000673-MLYS0-A | Shaking homogenizer |
| MOG 35-55 Peptide | Innovagen | N/A | |
| Montanide ISA 51 VG | Seppic | 36362Z | FDA-approved oil adjuvant |
| Pall Acrodisc Syringe Filters 0.2 μm | Fisher Scientific | 17124381 | Sterlie filter |
| PBS, Ca2+/Mg2+ free | Thermo Fisher Scientific | 14190144 | PBS |
| Phase-Constrast Microscope | Olympus | BX40-B | |
| Steel Beads 3.2 mm | Fisher Scientific | NC0445832 | Autoclave and store at RT |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 648463 | Store at RT |
References
- Walton, C., et al. Rising prevalence of multiple sclerosis worldwide: Insights from the Atlas of MS, third edition. Multiple Sclerosis. 26 (14), 1816-1821 (2020).
- van Langelaar, J., Rijvers, L., Smolders, J., van Luijn, M. M. B and T cells driving multiple sclerosis: identity, mechanisms and potential triggers. Frontiers in Immunology. 11, 760 (2020).
- Sambucci, M., Gargano, F., Guerrera, G., Battistini, L., Borsellino, G. One, No One, and One Hundred Thousand: T Regulatory Cells’ Multiple Identities in Neuroimmunity. Frontiers in Immunology. 10, 2947 (2019).
- Mix, E., Meyer-Rienecker, H., Hartung, H. P., Zettl, U. K. Animal models of multiple sclerosis–potentials and limitations. Progress in Neurobiology. 92 (3), 386-404 (2010).
- Terry, R. L., Ifergan, I., Miller, S. D. Experimental Autoimmune Encephalomyelitis in Mice. Methods in Molecular Biology. 1304, 145-160 (2016).
- Topping, L. M., et al. Standardization of antigen-emulsion preparations for the induction of autoimmune disease models. Frontiers in Immunology. 13, 892251 (2022).
- Flies, D. B., Chen, L. A simple and rapid vortex method for preparing antigen/adjuvant emulsions for immunization. Journal of Immunological Methods. 276 (1-2), 239-242 (2003).
- Määttä, J. A., Erälinna, J. P., Röyttä, M., Salmi, A. A., Hinkkanen, A. E. Physical state of the neuroantigen in adjuvant emulsions determines encephalitogenic status in the BALB/c mouse. Journal of Immunological Methods. 190 (1), 133-141 (1996).
- Moncada, C., Torres, V., Israel, Y. Simple method for the preparation of antigen emulsions for immunization. Journal of Immunological Methods. 162 (1), 133-140 (1993).
- Waksman, B. H., Adams, R. D. Allergic neuritis: an experimental disease of rabbits induced by the injection of peripheral nervous tissue and adjuvants. The Journal of Experimental Medicine. 102 (2), 213-236 (1955).
- Vladutiu, A. O., Rose, N. R. Autoimmune murine thyroiditis relation to histocompatibility (H-2) type. Science. 174 (4014), 1137-1139 (1971).
- Caspi, R. R. Experimental autoimmune uveoretinitis in the rat and mouse. Current Protocols in Immunology. , (2003).
- Tuzun, E., et al. Guidelines for standard preclinical experiments in the mouse model of myasthenia gravis induced by acetylcholine receptor immunization. Experimental Neurology. 270, 11-17 (2015).
- Brinckerhoff, L. H., et al. Terminal modifications inhibit proteolytic degradation of an immunogenic MART-1(27-35) peptide: implications for peptide vaccines. International Journal of Cancer. 83 (3), 326-334 (1999).
- Kool, M., et al. Alum adjuvant boosts adaptive immunity by inducing uric acid and activating inflammatory dendritic cells. The Journal of Experimental Medicine. 205 (4), 869-882 (2008).
- Hasselmann, J. P. C., Karim, H., Khalaj, A. J., Ghosh, S., Tiwari-Woodruff, S. K. Consistent induction of chronic experimental autoimmune encephalomyelitis in C57BL/6 mice for the longitudinal study of pathology and repair. Journal of Neuroscience Methods. 284, 71-84 (2017).
- Freund, J., Lipton, M. M. Experimental allergic encephalomyelitis after the excision of the injection site of antigen-adjuvant emulsion. The Journal of Immunology. 75 (6), 454-459 (1955).
- Stromnes, I. M., Goverman, J. M. Active induction of experimental allergic encephalomyelitis. Nature Protocols. 1 (4), 1810-1819 (2006).
- Shaw, M. K., Zhao, X. Q., Tse, H. Y. Overcoming unresponsiveness in experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) resistant mouse strains by adoptive transfer and antigenic challenge. Journal of Visualized Experiments. (62), e3778 (2012).
- Arevalo-Herrera, M., et al. Randomized clinical trial to assess the protective efficacy of a Plasmodium vivax CS synthetic vaccine. Nature Communications. 13 (1), 1603 (2022).
- Jiang, C., et al. Potential association factors for developing effective peptide-based cancer vaccines. Frontiers in Immunology. 13, 931612 (2022).
- Neninger Vinageras, E., et al. Phase II randomized controlled trial of an epidermal growth factor vaccine in advanced non-small-cell lung cancer. Journal of Clinical Oncology. 26 (9), 1452-1458 (2008).
