実験的自己免疫性脳脊髄炎を誘発するための抗原/アジュバントエマルジョンを調製するための迅速、簡便、標準化されたホモジナイズ法
Summary
多発性硬化症の動物モデルである実験的自己免疫性脳脊髄炎を誘発するために、マウスを自己抗原および完全なフロイントアジュバントを含む油中水型エマルジョンで免疫する。これらのエマルジョンの調製にはいくつかのプロトコルがありますが、ここでは、エマルジョン調製のための迅速で単純で標準化された均質化プロトコルを示します。
Abstract
実験的自己免疫性脳脊髄炎(EAE)は、多発性硬化症(MS)と同様の免疫学的および臨床的特徴を共有しているため、より良い患者治療のための新しい薬物標的を特定するためのモデルとして広く使用されています。MSは、再発寛解型MS(RRMS)、原発性進行型MS(PPMS)、二次進行型MS(SPMS)、およびまれな進行性再発型のMS(PRMS)など、いくつかの異なる疾患経過を特徴としています。動物モデルは、これらの対照的なヒト疾患表現型のすべてを正確に模倣するわけではありませんが、MSのさまざまな臨床症状のいくつかを反映するEAEモデルがあります。例えば、C57BL/6Jマウスのミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質(MOG)誘導性EAEはヒトPPMSを模倣し、SJL/Jマウスのミエリンプロテオリピドタンパク質(PLP)誘導EAEはRRMSに類似しています。ミエリン塩基性タンパク質(MBP)などの他の自己抗原、および多数の異なるマウス系統もEAEの研究に使用されます。これらの自己抗原免疫EAEモデルにおいて疾患を誘導するために、油中水型エマルジョンを調製し、皮下注射する。EAEモデルの大部分は、百日咳毒素の注射も必要とします 病気が発症するために。一貫性のある再現性のあるEAE誘導のためには、抗原/アジュバントエマルジョンを製造するための試薬を調製するための詳細なプロトコルが必要です。ここで説明する方法は、標準化された方法を利用して油中水型エマルジョンを生成します。シンプルで高速で、シリンジの代わりに振とうホモジナイザーを使用して品質管理されたエマルジョンを調製します。
Introduction
免疫寛容の崩壊は、多発性硬化症(MS)などの自己免疫疾患の発生につながる可能性があります。世界中で280万人がMSとともに生活していると推定されています1。MSの正確な原因はまだほとんど不明ですが、自己反応性T細胞とB細胞の調節不全、およびTreg機能の欠陥は、疾患の病因に重要な役割を果たしています2,3。
自己免疫疾患の動物モデルは、潜在的な治療法を調査するために不可欠なツールです。実験的自己免疫性脳脊髄炎(EAE)モデルは、MS4に関心のある研究者によってほぼ1世紀にわたって使用されてきました。初期の実験では、この病気の発生率は比較的低かった。 マイコバクテリウム と百日咳毒素を含む完全フロイントアジュバント(CFA)の導入により、マウスにおけるEAEの一貫した誘導が可能になりました4。最も重要なことは、CFAを中枢神経系(CNS)特異的抗原と混合して、EAEを誘導するための均質な油中水型エマルジョンを生成する必要があることです。現在利用可能な最も一般的なEAEモデルは、脳原性ペプチドによるマウスの能動免疫に基づいています。マウスの遺伝的背景は疾患感受性に重要な役割を果たしており、ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質(MOG35-55)およびミエリンプロテオリピドタンパク質(PLP139-151)ペプチドは、それぞれC57BL/6JおよびSJLマウスにおいてEAEを誘導するために用いられている5。しかしながら、他のマウス系統およびCNS由来ペプチドも使用することができる。
CFA/ペプチドエマルジョンの品質は、能動免疫EAEモデルにおける疾患浸透率を決定する重要な要素です6。均質な油中水型エマルジョンは、水性緩衝液に溶解した脳形成ペプチドをCFAと混合することによって調製されなければならず、そうでなければ動物は疾患を発症しないであろう。CFA/ペプチドエマルジョンの調製に関する多数のプロトコルが公開されています。例としては、渦7、超音波処理8、シリンジおよび三方Tコネクタ9、または1つのシリンジのみ5の使用が含まれる。ただし、これらの方法はすべて標準化が難しく、多くの場合、長く複雑なプロトコルに関連付けられています。
上記のすべての方法と比較して、エマルジョン調製のためにここで説明する簡単な方法は、人間の違いがなく、比較的高速であるという利点を提供します。エマルジョンは、設定された速度、時間、温度で試薬を振とうするホモジナイザーによって生成され、高速で一貫した結果を保証します。この方法は、EAEモデルで疾患を誘発するだけでなく、コラーゲン誘発関節炎(CIA)や抗原誘発関節炎(AIA)などの他の自己免疫疾患モデルの研究にも使用できます6。したがって、この方法は、実験的自己免疫性神経炎(EAN)10、実験的自己免疫性甲状腺炎(EAT)11、自己免疫性ブドウ膜炎(EAU)12、重症筋無力症(MG)13など、自己抗原を含む油中水型エマルジョンに依存する他の動物モデルで疾患を一貫して誘発するために使用できることが期待されます。この方法はまた、遅延型過敏症(DTH)などの一般的な免疫応答を一貫して誘導するため6、癌やマラリアワクチンの送達に使用できる可能性があります(議論を参照)。
したがって、迅速(総調製時間~30分)、単純(すべての試薬を事前に調製して保存することができる)、および標準化された(エマルジョンは振とうホモジナイザーを使用して達成される)方法が開発され、ここに提示されています。このプロトコルを使用して調製されたCFA /抗原エマルジョンは、自己免疫動物モデルで一貫して疾患を誘発します。
Protocol
Representative Results
Discussion
抗原/フロイントアジュバントなどの油中水型エマルジョンは、EAE17を誘導するために半世紀以上にわたって使用されてきました。現在、ヒトの影響に依存しない抗原乳剤を調製するための標準化された方法はありません。シリンジを使用した手動混合はほとんどの研究室で標準的ですが、この方法は時間がかかり、多くの場合、材料の過度の損失をもたらし、品質は準備す?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者は、ルンド大学の動物飼育ユニットであるカミラ・ビョルクレフとアグニエシュカ・チョペックの支援、および英国オックスフォード大学ケネディリウマチ研究所のリチャード・ウィリアムズがこの原稿の作成について建設的な批判と言語的支援を行ったことに感謝したいと思います。
Materials
| 1 mL Injection syringe | B. Braun | 9166017V | |
| 1 mL Injection syringe | Sigma-Aldrich | Z683531 | |
| 7 ml empty tubes with caps | Bertin-Instruments | P000944LYSK0A.0 | 7 mL tube |
| 50 mL sterile centrifuge tube | Fisher Scientific | 10788561 | 50 mL tube |
| Bordetella pertussis toxin | Sigma-Aldrich | P2980 | Store at -20 °C |
| Dispersant, light mineral oil | Sigma-Aldrich | M8410 | Store at RT |
| Emulsion kit | Bertin-Instruments | D34200.10 ea | Containing a tube, cap, and plunger |
| Incomplete Freund's Adjuvant | Sigma-Aldrich | F5506 | Store at +4 °C |
| Mycobacterium tuberculosis, H37RA | Fisher Scientific | DF3114-33-8 | Store at +4 °C |
| Mastersizer 2000 | Malvern Panalytical | N/A | Particle size analyzer |
| Minilys-Personal homogenizer | Bertin-Instruments | P000673-MLYS0-A | Shaking homogenizer |
| MOG 35-55 Peptide | Innovagen | N/A | |
| Montanide ISA 51 VG | Seppic | 36362Z | FDA-approved oil adjuvant |
| Pall Acrodisc Syringe Filters 0.2 μm | Fisher Scientific | 17124381 | Sterlie filter |
| PBS, Ca2+/Mg2+ free | Thermo Fisher Scientific | 14190144 | PBS |
| Phase-Constrast Microscope | Olympus | BX40-B | |
| Steel Beads 3.2 mm | Fisher Scientific | NC0445832 | Autoclave and store at RT |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 648463 | Store at RT |
References
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