En rask, enkel og standardisert homogeniseringsmetode for å fremstille antigen / adjuvante emulsjoner for å indusere eksperimentell autoimmun encefalomyelitt
Summary
For å indusere eksperimentell autoimmun encefalomyelitt, en dyremodell av multippel sklerose, immuniseres mus med en vann-i-olje-emulsjon som inneholder et autoantigen og fullfører Freunds adjuvans. Mens det finnes flere protokoller for fremstilling av disse emulsjonene, presenteres en rask, enkel og standardisert homogeniseringsprotokoll for emulsjonsfremstilling her.
Abstract
Eksperimentell autoimmun encefalomyelitt (EAE) deler lignende immunologiske og kliniske trekk med multippel sklerose (MS), og er derfor mye brukt som modell for å identifisere nye legemiddelmål for bedre pasientbehandling. MS er preget av flere forskjellige sykdomsforløp: relapsing-remitting MS (RRMS), primær progressiv MS (PPMS), sekundær progressiv MS (SPMS), og en sjelden progressiv-relapsing form for MS (PRMS). Selv om dyremodeller ikke nøyaktig etterligner alle disse kontrasterende humane sykdomsfenotypene, er det EAE-modeller som gjenspeiler noen av de forskjellige kliniske manifestasjonene av MS. For eksempel etterligner myelin oligodendrocytt glykoprotein (MOG) -indusert EAE i C57BL / 6J mus human PPMS, mens myelin proteolipidprotein (PLP) -indusert EAE i SJL / J mus ligner RRMS. Andre autoantigener, som myelin basisk protein (MBP), og en rekke forskjellige musestammer brukes også til å studere EAE. For å indusere sykdom i disse autoantigen-immunisering EAE-modellene, fremstilles en vann-i-olje-emulsjon og injiseres subkutant. De fleste EAE-modeller krever også en injeksjon av kikhostetoksin for at sykdommen skal utvikle seg. For konsistent og reproduserbar EAE-induksjon er det nødvendig med en detaljert protokoll for å fremstille reagensene for å produsere antigen / adjuvante emulsjoner. Metoden beskrevet her utnytter en standardisert metode for å generere vann-i-olje-emulsjoner. Det er enkelt og raskt og bruker en risting homogenisator i stedet for sprøyter for å forberede kvalitetskontrollerte emulsjoner.
Introduction
En sammenbrudd av immunologisk toleranse kan resultere i generering av autoimmune lidelser, som multippel sklerose (MS). Det anslås at 2,8 millioner mennesker lever medMS over hele verden 1. Selv om den eksakte årsaken til MS fortsatt i stor grad er ukjent, spiller dysregulering av autoreaktive T- og B-celler, samt defekter i Treg-funksjonen, viktige roller i patogenesen av sykdommen 2,3.
Dyremodeller av autoimmune sykdommer er viktige verktøy for å undersøke potensielle terapeutiske modaliteter. Den eksperimentelle autoimmune encefalomyelitt (EAE) -modellen har blitt brukt i nesten et århundre av forskere interessert i MS4. I tidlige eksperimenter var forekomsten av sykdommen relativt lav. Introduksjonen av komplett Freunds adjuvans (CFA), som inneholder Mycobacterium og kikhostetoksin, muliggjorde konsekvent induksjon av EAE hos mus4. Viktigst er det nødvendig å blande CFA med et sentralnervesystemet (CNS) -spesifikt antigen for å generere en homogen vann-i-olje-emulsjon for å indusere EAE. De vanligste tilgjengelige EAE-modellene er basert på aktiv immunisering av mus med encefalitogene peptider. Den genetiske bakgrunnen til musene spiller en viktig rolle i sykdomsfølsomhet, med myelin oligodendrocytt glykoprotein (MOG35-55) og myelin proteolipidprotein (PLP139-151) peptider som brukes til å indusere EAE i henholdsvis C57BL / 6J og SJL mus, henholdsvis5. Imidlertid kan andre musestammer og CNS-avledede peptider også brukes.
Kvaliteten på CFA/peptidemulsjonen er en kritisk faktor som bestemmer sykdomspenetrans i den aktive immuniseringen EAE modell6. En homogen vann-i-olje-emulsjon må fremstilles ved å blande de encefalitogene peptidene oppløst i vandig buffer med CFA, ellers vil dyr ikke utvikle sykdommen. Tallrike protokoller er publisert om fremstilling av CFA / peptidemulsjoner. Eksempler inkluderer bruk av en vortex7, sonikering8, sprøyter og en treveis T-kontakt9, eller en sprøyte bare5. Imidlertid er alle disse metodene vanskelige å standardisere og er ofte forbundet med lange og kompliserte protokoller.
Sammenlignet med alle de ovennevnte metodene, gir den enkle metoden beskrevet her for emulsjonsfremstilling fordelene ved å ikke ha noen person-til-person-forskjeller og være relativt rask. Emulsjonen genereres av en homogenisator som rister reagensene med en angitt hastighet, tid og temperatur, noe som sikrer raske og konsistente resultater. I tillegg til å indusere sykdom i EAE-modellen, kan denne metoden også brukes til å studere andre autoimmune sykdomsmodeller som kollagenindusert artritt (CIA) og antigenindusert artritt (AIA)6. Derfor forventes det at denne metoden kan brukes til konsekvent å indusere sykdom i andre dyremodeller som er avhengige av vann-i-olje-emulsjoner med autoantigener, som eksperimentell autoimmun neuritt (EAN)10, eksperimentell autoimmun tyroiditt (EAT)11, autoimmun uveitt (EAU)12 og myasthenia gravis (MG)13. Denne metoden induserer også generelle immunresponser som forsinket hypersensitivitet (DTH) konsekvent6, og kan derfor brukes til å levere kreft- og malariavaksiner (se diskusjon).
Således er det utviklet en rask (total forberedelsestid ~ 30 min), enkel (alle reagenser kan fremstilles på forhånd og lagres) og standardisert (emulsjonen oppnås ved hjelp av en risting homogenisator) metode og presenteres her. CFA / antigenemulsjonene fremstilt ved bruk av denne protokollen induserer konsekvent sykdom i autoimmune dyremodeller.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vann-i-olje-emulsjoner, som antigen / Freunds adjuvans, har blitt brukt i mer enn et halvt århundre for å indusere EAE17. Det er for tiden ingen standardisert metode for å fremstille antigenemulsjoner som er uavhengig av menneskelig påvirkning. Manuell blanding ved hjelp av sprøyter er standard for de fleste laboratorier, men denne metoden er tidkrevende, resulterer ofte i et overdreven tap av materiale, og kvaliteten varierer avhengig av forskeren som forbereder den.
<p class="jove_conte…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatteren ønsker å anerkjenne dyreboligene ved Lunds universitet, Camilla Björklöv og Agnieszka Czopek, for deres støtte, og Richard Williams, Kennedy Institute of Rheumatology, University of Oxford, Storbritannia, for konstruktiv kritikk og språklig støtte som produserer dette manuskriptet.
Materials
| 1 mL Injection syringe | B. Braun | 9166017V | |
| 1 mL Injection syringe | Sigma-Aldrich | Z683531 | |
| 7 ml empty tubes with caps | Bertin-Instruments | P000944LYSK0A.0 | 7 mL tube |
| 50 mL sterile centrifuge tube | Fisher Scientific | 10788561 | 50 mL tube |
| Bordetella pertussis toxin | Sigma-Aldrich | P2980 | Store at -20 °C |
| Dispersant, light mineral oil | Sigma-Aldrich | M8410 | Store at RT |
| Emulsion kit | Bertin-Instruments | D34200.10 ea | Containing a tube, cap, and plunger |
| Incomplete Freund's Adjuvant | Sigma-Aldrich | F5506 | Store at +4 °C |
| Mycobacterium tuberculosis, H37RA | Fisher Scientific | DF3114-33-8 | Store at +4 °C |
| Mastersizer 2000 | Malvern Panalytical | N/A | Particle size analyzer |
| Minilys-Personal homogenizer | Bertin-Instruments | P000673-MLYS0-A | Shaking homogenizer |
| MOG 35-55 Peptide | Innovagen | N/A | |
| Montanide ISA 51 VG | Seppic | 36362Z | FDA-approved oil adjuvant |
| Pall Acrodisc Syringe Filters 0.2 μm | Fisher Scientific | 17124381 | Sterlie filter |
| PBS, Ca2+/Mg2+ free | Thermo Fisher Scientific | 14190144 | PBS |
| Phase-Constrast Microscope | Olympus | BX40-B | |
| Steel Beads 3.2 mm | Fisher Scientific | NC0445832 | Autoclave and store at RT |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 648463 | Store at RT |
References
- Walton, C., et al. Rising prevalence of multiple sclerosis worldwide: Insights from the Atlas of MS, third edition. Multiple Sclerosis. 26 (14), 1816-1821 (2020).
- van Langelaar, J., Rijvers, L., Smolders, J., van Luijn, M. M. B and T cells driving multiple sclerosis: identity, mechanisms and potential triggers. Frontiers in Immunology. 11, 760 (2020).
- Sambucci, M., Gargano, F., Guerrera, G., Battistini, L., Borsellino, G. One, No One, and One Hundred Thousand: T Regulatory Cells’ Multiple Identities in Neuroimmunity. Frontiers in Immunology. 10, 2947 (2019).
- Mix, E., Meyer-Rienecker, H., Hartung, H. P., Zettl, U. K. Animal models of multiple sclerosis–potentials and limitations. Progress in Neurobiology. 92 (3), 386-404 (2010).
- Terry, R. L., Ifergan, I., Miller, S. D. Experimental Autoimmune Encephalomyelitis in Mice. Methods in Molecular Biology. 1304, 145-160 (2016).
- Topping, L. M., et al. Standardization of antigen-emulsion preparations for the induction of autoimmune disease models. Frontiers in Immunology. 13, 892251 (2022).
- Flies, D. B., Chen, L. A simple and rapid vortex method for preparing antigen/adjuvant emulsions for immunization. Journal of Immunological Methods. 276 (1-2), 239-242 (2003).
- Määttä, J. A., Erälinna, J. P., Röyttä, M., Salmi, A. A., Hinkkanen, A. E. Physical state of the neuroantigen in adjuvant emulsions determines encephalitogenic status in the BALB/c mouse. Journal of Immunological Methods. 190 (1), 133-141 (1996).
- Moncada, C., Torres, V., Israel, Y. Simple method for the preparation of antigen emulsions for immunization. Journal of Immunological Methods. 162 (1), 133-140 (1993).
- Waksman, B. H., Adams, R. D. Allergic neuritis: an experimental disease of rabbits induced by the injection of peripheral nervous tissue and adjuvants. The Journal of Experimental Medicine. 102 (2), 213-236 (1955).
- Vladutiu, A. O., Rose, N. R. Autoimmune murine thyroiditis relation to histocompatibility (H-2) type. Science. 174 (4014), 1137-1139 (1971).
- Caspi, R. R. Experimental autoimmune uveoretinitis in the rat and mouse. Current Protocols in Immunology. , (2003).
- Tuzun, E., et al. Guidelines for standard preclinical experiments in the mouse model of myasthenia gravis induced by acetylcholine receptor immunization. Experimental Neurology. 270, 11-17 (2015).
- Brinckerhoff, L. H., et al. Terminal modifications inhibit proteolytic degradation of an immunogenic MART-1(27-35) peptide: implications for peptide vaccines. International Journal of Cancer. 83 (3), 326-334 (1999).
- Kool, M., et al. Alum adjuvant boosts adaptive immunity by inducing uric acid and activating inflammatory dendritic cells. The Journal of Experimental Medicine. 205 (4), 869-882 (2008).
- Hasselmann, J. P. C., Karim, H., Khalaj, A. J., Ghosh, S., Tiwari-Woodruff, S. K. Consistent induction of chronic experimental autoimmune encephalomyelitis in C57BL/6 mice for the longitudinal study of pathology and repair. Journal of Neuroscience Methods. 284, 71-84 (2017).
- Freund, J., Lipton, M. M. Experimental allergic encephalomyelitis after the excision of the injection site of antigen-adjuvant emulsion. The Journal of Immunology. 75 (6), 454-459 (1955).
- Stromnes, I. M., Goverman, J. M. Active induction of experimental allergic encephalomyelitis. Nature Protocols. 1 (4), 1810-1819 (2006).
- Shaw, M. K., Zhao, X. Q., Tse, H. Y. Overcoming unresponsiveness in experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) resistant mouse strains by adoptive transfer and antigenic challenge. Journal of Visualized Experiments. (62), e3778 (2012).
- Arevalo-Herrera, M., et al. Randomized clinical trial to assess the protective efficacy of a Plasmodium vivax CS synthetic vaccine. Nature Communications. 13 (1), 1603 (2022).
- Jiang, C., et al. Potential association factors for developing effective peptide-based cancer vaccines. Frontiers in Immunology. 13, 931612 (2022).
- Neninger Vinageras, E., et al. Phase II randomized controlled trial of an epidermal growth factor vaccine in advanced non-small-cell lung cancer. Journal of Clinical Oncology. 26 (9), 1452-1458 (2008).
