En snabb, enkel och standardiserad homogeniseringsmetod för att framställa antigen/ adjuvansemulsioner för att inducera experimentell autoimmun encefalomyelit
Summary
För att inducera experimentell autoimmun encefalomyelit, en djurmodell av multipel skleros, immuniseras möss med en vatten-i-olja-emulsion innehållande ett autoantigen och kompletterar Freunds adjuvans. Medan flera protokoll finns för beredning av dessa emulsioner, presenteras ett snabbt, enkelt och standardiserat homogeniseringsprotokoll för emulsionsberedning här.
Abstract
Experimentell autoimmun encefalomyelit (EAE) delar liknande immunologiska och kliniska egenskaper med multipel skleros (MS), och används därför i stor utsträckning som en modell för att identifiera nya läkemedelsmål för bättre patientbehandling. MS kännetecknas av flera olika sjukdomsförlopp: skovvis förlöpande MS (RRMS), primär progressiv MS (PPMS), sekundär progressiv MS (SPMS) och en sällsynt progressiv återfallande form av MS (PRMS). Även om djurmodeller inte exakt efterliknar alla dessa kontrasterande fenotyper av mänskliga sjukdomar, finns det EAE-modeller som återspeglar några av de olika kliniska manifestationerna av MS. Till exempel efterliknar myelinoligodendrocytglykoprotein (MOG) -inducerad EAE i C57BL / 6J-möss humant PPMS, medan myelinproteolipidprotein (PLP) -inducerad EAE i SJL / J-möss liknar RRMS. Andra autoantigener, såsom myelinbasiskt protein (MBP), och ett antal olika musstammar används också för att studera EAE. För att inducera sjukdom i dessa autoantigen-immunisering EAE-modeller framställs en vatten-i-olja-emulsion och injiceras subkutant. Majoriteten av EAE-modellerna kräver också en injektion av kikhosttoxin för att sjukdomen ska utvecklas. För konsekvent och reproducerbar EAE-induktion krävs ett detaljerat protokoll för att förbereda reagenserna för att producera antigen-/adjuvansemulsioner. Metoden som beskrivs här utnyttjar en standardiserad metod för att generera vatten-i-olja-emulsioner. Det är enkelt och snabbt och använder en skakande homogenisator istället för sprutor för att förbereda kvalitetskontrollerade emulsioner.
Introduction
En nedbrytning av immunologisk tolerans kan resultera i generering av autoimmuna störningar, såsom multipel skleros (MS). Det uppskattas att 2,8 miljoner människor lever med MS över hela världen1. Även om den exakta orsaken till MS fortfarande är till stor del okänd, spelar dysreglering av autoreaktiva T- och B-celler, liksom defekter i Treg-funktionen, viktiga roller i patogenesen av sjukdomen 2,3.
Djurmodeller av autoimmuna sjukdomar är viktiga verktyg för att undersöka potentiella terapeutiska metoder. Den experimentella modellen för autoimmun encefalomyelit (EAE) har använts i nästan ett sekel av forskare som är intresserade av MS4. I tidiga experiment var förekomsten av sjukdomen relativt låg. Introduktionen av komplett Freunds adjuvans (CFA), innehållande Mycobacterium och kikhosttoxin, möjliggjorde konsekvent induktion av EAE i möss4. Viktigast av allt är att det är nödvändigt att blanda CFA med ett antigen i centrala nervsystemet (CNS) för att generera en homogen vatten-i-olja-emulsion för att inducera EAE. De vanligaste för närvarande tillgängliga EAE-modellerna är baserade på aktiv immunisering av möss med encefalitogena peptider. Mössens genetiska bakgrund spelar en viktig roll för sjukdomskänslighet, med myelinoligodendrocytglykoprotein (MOG35-55) och myelinproteolipidprotein (PLP139-151) peptider som används för att inducera EAE i C57BL / 6J respektive SJL-möss5. Andra musstammar och CNS-härledda peptider kan dock också användas.
Kvaliteten på CFA/peptidemulsionen är en kritisk faktor som bestämmer sjukdomspenetransen i den aktiva immuniseringsmodellenEAE modell 6. En homogen vatten-i-olja-emulsion måste framställas genom att blanda de encefalitogena peptiderna upplösta i vattenhaltig buffert med CFA, annars kommer djur inte att utveckla sjukdomen. Många protokoll har publicerats om beredning av CFA/peptidemulsioner. Exempel inkluderar användning av en virvel7, ultraljudsbehandling8, sprutor och en trevägs T-kontakt9, eller en spruta endast5. Alla dessa metoder är dock svåra att standardisera och är ofta förknippade med långa och komplicerade protokoll.
Jämfört med alla ovanstående metoder erbjuder den enkla metoden som beskrivs här för emulsionsberedning fördelarna med att inte ha några person-till-person-skillnader och vara relativt snabb. Emulsionen genereras av en homogenisator som skakar reagenserna med en inställd hastighet, tid och temperatur, vilket säkerställer snabba och konsekventa resultat. Förutom att inducera sjukdom i EAE-modellen kan denna metod också användas för att studera andra autoimmuna sjukdomsmodeller såsom kollageninducerad artrit (CIA) och antigeninducerad artrit (AIA)6. Därför förväntas denna metod kunna användas för att konsekvent inducera sjukdom i andra djurmodeller som är beroende av vatten-i-olja-emulsioner med autoantigener, såsom experimentell autoimmun neurit (EAN)10, experimentell autoimmun tyreoidit (EAT)11, autoimmun uveit (EAU)12 och myasthenia gravis (MG)13. Denna metod inducerar också allmänna immunsvar som fördröjd överkänslighet (DTH) konsekvent6, och kan därför användas för att leverera cancer- och malariavacciner (se diskussion).
Således har en snabb (total beredningstid ~ 30 min), enkel (alla reagenser kan förberedas i förväg och lagras) och standardiserad (emulsionen uppnås med hjälp av en skakningshomogenisator) metod utvecklats och presenteras här. CFA/antigenemulsioner framställda med hjälp av detta protokoll inducerar konsekvent sjukdom i autoimmuna djurmodeller.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vatten-i-olja-emulsioner, såsom antigen/Freunds adjuvans, har använts i mer än ett halvt sekel för att inducera EAE17. Det finns för närvarande ingen standardiserad metod för att framställa antigenemulsioner som är oberoende av mänsklig påverkan. Manuell blandning med sprutor är standard för de flesta laboratorier, men denna metod är tidskrävande, resulterar ofta i en överdriven förlust av material och kvaliteten skiljer sig beroende på forskaren som förbereder den.
<p class…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författaren vill uppmärksamma djurhållningsenheterna vid Lunds universitet, Camilla Björklöv och Agnieszka Czopek, för deras stöd, och Richard Williams, Kennedy Institute of Rheumatology, University of Oxford, Storbritannien, för konstruktiv kritik och språkligt stöd för att producera detta manuskript.
Materials
| 1 mL Injection syringe | B. Braun | 9166017V | |
| 1 mL Injection syringe | Sigma-Aldrich | Z683531 | |
| 7 ml empty tubes with caps | Bertin-Instruments | P000944LYSK0A.0 | 7 mL tube |
| 50 mL sterile centrifuge tube | Fisher Scientific | 10788561 | 50 mL tube |
| Bordetella pertussis toxin | Sigma-Aldrich | P2980 | Store at -20 °C |
| Dispersant, light mineral oil | Sigma-Aldrich | M8410 | Store at RT |
| Emulsion kit | Bertin-Instruments | D34200.10 ea | Containing a tube, cap, and plunger |
| Incomplete Freund's Adjuvant | Sigma-Aldrich | F5506 | Store at +4 °C |
| Mycobacterium tuberculosis, H37RA | Fisher Scientific | DF3114-33-8 | Store at +4 °C |
| Mastersizer 2000 | Malvern Panalytical | N/A | Particle size analyzer |
| Minilys-Personal homogenizer | Bertin-Instruments | P000673-MLYS0-A | Shaking homogenizer |
| MOG 35-55 Peptide | Innovagen | N/A | |
| Montanide ISA 51 VG | Seppic | 36362Z | FDA-approved oil adjuvant |
| Pall Acrodisc Syringe Filters 0.2 μm | Fisher Scientific | 17124381 | Sterlie filter |
| PBS, Ca2+/Mg2+ free | Thermo Fisher Scientific | 14190144 | PBS |
| Phase-Constrast Microscope | Olympus | BX40-B | |
| Steel Beads 3.2 mm | Fisher Scientific | NC0445832 | Autoclave and store at RT |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 648463 | Store at RT |
References
- Walton, C., et al. Rising prevalence of multiple sclerosis worldwide: Insights from the Atlas of MS, third edition. Multiple Sclerosis. 26 (14), 1816-1821 (2020).
- van Langelaar, J., Rijvers, L., Smolders, J., van Luijn, M. M. B and T cells driving multiple sclerosis: identity, mechanisms and potential triggers. Frontiers in Immunology. 11, 760 (2020).
- Sambucci, M., Gargano, F., Guerrera, G., Battistini, L., Borsellino, G. One, No One, and One Hundred Thousand: T Regulatory Cells’ Multiple Identities in Neuroimmunity. Frontiers in Immunology. 10, 2947 (2019).
- Mix, E., Meyer-Rienecker, H., Hartung, H. P., Zettl, U. K. Animal models of multiple sclerosis–potentials and limitations. Progress in Neurobiology. 92 (3), 386-404 (2010).
- Terry, R. L., Ifergan, I., Miller, S. D. Experimental Autoimmune Encephalomyelitis in Mice. Methods in Molecular Biology. 1304, 145-160 (2016).
- Topping, L. M., et al. Standardization of antigen-emulsion preparations for the induction of autoimmune disease models. Frontiers in Immunology. 13, 892251 (2022).
- Flies, D. B., Chen, L. A simple and rapid vortex method for preparing antigen/adjuvant emulsions for immunization. Journal of Immunological Methods. 276 (1-2), 239-242 (2003).
- Määttä, J. A., Erälinna, J. P., Röyttä, M., Salmi, A. A., Hinkkanen, A. E. Physical state of the neuroantigen in adjuvant emulsions determines encephalitogenic status in the BALB/c mouse. Journal of Immunological Methods. 190 (1), 133-141 (1996).
- Moncada, C., Torres, V., Israel, Y. Simple method for the preparation of antigen emulsions for immunization. Journal of Immunological Methods. 162 (1), 133-140 (1993).
- Waksman, B. H., Adams, R. D. Allergic neuritis: an experimental disease of rabbits induced by the injection of peripheral nervous tissue and adjuvants. The Journal of Experimental Medicine. 102 (2), 213-236 (1955).
- Vladutiu, A. O., Rose, N. R. Autoimmune murine thyroiditis relation to histocompatibility (H-2) type. Science. 174 (4014), 1137-1139 (1971).
- Caspi, R. R. Experimental autoimmune uveoretinitis in the rat and mouse. Current Protocols in Immunology. , (2003).
- Tuzun, E., et al. Guidelines for standard preclinical experiments in the mouse model of myasthenia gravis induced by acetylcholine receptor immunization. Experimental Neurology. 270, 11-17 (2015).
- Brinckerhoff, L. H., et al. Terminal modifications inhibit proteolytic degradation of an immunogenic MART-1(27-35) peptide: implications for peptide vaccines. International Journal of Cancer. 83 (3), 326-334 (1999).
- Kool, M., et al. Alum adjuvant boosts adaptive immunity by inducing uric acid and activating inflammatory dendritic cells. The Journal of Experimental Medicine. 205 (4), 869-882 (2008).
- Hasselmann, J. P. C., Karim, H., Khalaj, A. J., Ghosh, S., Tiwari-Woodruff, S. K. Consistent induction of chronic experimental autoimmune encephalomyelitis in C57BL/6 mice for the longitudinal study of pathology and repair. Journal of Neuroscience Methods. 284, 71-84 (2017).
- Freund, J., Lipton, M. M. Experimental allergic encephalomyelitis after the excision of the injection site of antigen-adjuvant emulsion. The Journal of Immunology. 75 (6), 454-459 (1955).
- Stromnes, I. M., Goverman, J. M. Active induction of experimental allergic encephalomyelitis. Nature Protocols. 1 (4), 1810-1819 (2006).
- Shaw, M. K., Zhao, X. Q., Tse, H. Y. Overcoming unresponsiveness in experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) resistant mouse strains by adoptive transfer and antigenic challenge. Journal of Visualized Experiments. (62), e3778 (2012).
- Arevalo-Herrera, M., et al. Randomized clinical trial to assess the protective efficacy of a Plasmodium vivax CS synthetic vaccine. Nature Communications. 13 (1), 1603 (2022).
- Jiang, C., et al. Potential association factors for developing effective peptide-based cancer vaccines. Frontiers in Immunology. 13, 931612 (2022).
- Neninger Vinageras, E., et al. Phase II randomized controlled trial of an epidermal growth factor vaccine in advanced non-small-cell lung cancer. Journal of Clinical Oncology. 26 (9), 1452-1458 (2008).
