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Bioengineering

Microvascular Fragments에서 Vascularized Thermogenic Adipose Tissue의 3차원 배양

Published: February 03, 2023
doi:
10.3791/64650
, , , , ,
1Department of Biochemistry and Structural Biology,University of Texas Health Science Center, 2Department of Biomedical Engineering and Chemical Engineering,University of Texas at San Antonio, 3Institute of Regenerative Medicine,University of Texas at San Antonio

Summary

여기에서 우리는 기능적 혈관화된 베이지색 지방 조직을 엔지니어링하기 위한 간단한 접근 방식으로 설치류 또는 인간 지방 조직에서 분리된 미세혈관 조각의 사용을 설명하는 자세한 프로토콜을 제시합니다.

Abstract

공학적 열 발생 지방 조직(예: 베이지색 또는 갈색 지방 조직)은 대사 질환에 대한 잠재적 치료법 또는 건강 검진 및 약물 검사를 위한 개인화된 미세 조직의 설계를 위한 것으로 조사되었습니다. 현재의 전략은 종종 매우 복잡하며 열 발생 지방 조직의 다세포 및 기능적 특성을 정확하게 완전히 묘사하지 못합니다. 지방 조직에서 분리된 세동맥, 세정맥 및 모세혈관으로 구성된 작고 손상되지 않은 미세혈관인 미세혈관 단편은 혈관화 및 지방 조직 형성을 가능하게 하는 단일 자가 세포 공급원 역할을 합니다. 이 기사에서는 지방 조직 및 배양 조건에서 미세혈관 단편을 분리하기 위한 프로토콜을 포함하여 미세혈관 조각에서 3차원, 혈관화 및 기능적 열발생 지방 조직을 생성할 수 있도록 배양 조건을 최적화하는 방법을 설명합니다. 또한 조작된 조직을 특성화하는 기술과 마찬가지로 모범 사례에 대해 논의하고 설치류 및 인간 미세혈관 단편의 샘플 결과를 제공합니다. 이 접근법은 비만 및 대사 질환 치료법의 이해와 개발에 활용될 가능성이 있습니다.

Introduction

이 프로토콜의 목표는 잠재적으로 자가 소스인 단일 미세혈관 단편(MVF)에서 혈관화된 베이지색 지방 조직을 개발하기 위한 접근 방식을 설명하는 것입니다. 갈색 및 베이지색 지방 조직은 대사 조절과 관련된 유익한 특성을 나타내는 것으로 입증되었습니다. 그러나, 성인의 이러한 지방 조직 저장소의 소량은 특히 비만이나 제2형 당뇨병과 같은 질병 상태에서 전신 대사에 대한 잠재적 영향을 제한한다 1,2,3,4,5,6,7. 비만 및 그 동반 질환과 관련된 유해한 대사 효과를 예방하기 위한 치료 표적으로서 갈색/베이지색 지방에 상당한 관심이 있습니다 8,9,10,11,12.

MVF는 지방 조직으로부터 직접 분리되고, 배양되고, 연장된 기간 동안 3차원 구성으로 유지될 수 있는 혈관 구조이다(13,14,15). 우리 그룹과 다른 사람들의 이전 연구는 특히 지방 조직 형성과 관련하여 MVF의 다세포 및 다능성 능력을 활용하기 시작했습니다16,17,18. 이 연구의 축적으로, 우리는 최근 건강한 제2형 당뇨병 및 제2형 당뇨병의 설치류 모델(19)과 인간 피험자(50세 이상의 성인)20에서 파생된 MVF가 열발생 또는 베이지색 지방 조직을 형성하도록 유도될 수 있는 세포를 함유하고 있음을 입증했습니다.

본원은 베이지색 지방 조직뿐만 아니라 그의 관련되고 중요한 혈관 성분(21)을 생성할 수 있는 단일 공급원 MVF가 활용되는 혁신적인 접근법이다. 이 기술의 사용은 열 발생 지방 조직 형성을 위한 간단한 조직 공학적 접근 방식을 찾는 연구에 큰 가치가 있을 수 있습니다. 베이지색 지방 조직 22,23,24,25,26,27,28을 조작하려는 다른 방법과 달리 이 연구에 설명된 프로세스는 여러 세포 유형이나 복잡한 유도 요법을 사용할 필요가 없습니다. 혈관화된 베이지색 및 백색 지방 모델은 설치류 및 인간 소스에서 유래한 MVF로 생성할 수 있어 뛰어난 번역 잠재력을 보여줍니다. 이 프로토콜의 최종 제품은 갈색 지방 조직에 필적하는 구조와 대사 기능을 가진 엔지니어링된 베이지색 열 발생 지방 조직입니다. 전반적으로, 이 프로토콜은 쉽게 접근할 수 있고 자가 소스 MVF가 대사 장애를 연구하기 위한 가치 있는 치료 개입 및 도구가 될 수 있다는 아이디어를 제시합니다.

Protocol

본 연구는 동물복지법 및 동물복지 시행규정에 따라 실험동물 관리 및 사용 가이드의 원칙에 따라 수행되었다. 모든 동물 절차는 샌안토니오에 있는 텍사스 대학교의 기관 동물 관리 및 사용 위원회의 승인을 받았습니다. 참고: 아래에 설명된 단계에서는 수컷 Lewis Rats가 사용됩니다. 암컷과 생쥐 미세혈관 조각(MVF) 수집에 대해 약간의 프로토콜 조정이 이루어져야 한다<sup clas…

Representative Results

베이지색/갈색 지방 조직의 몇 가지 주요 표현형 형태학적 특징이 있습니다: 다안성/작은 지질 방울을 포함하고, 많은 수의 미토콘드리아를 보유하고(생체 내에서 특징적으로 “갈색”으로 보이는 이유), 이에 따라 높은 산소 소비율/미토콘드리아 생물 에너지를 가지며, 혈관이 많이 형성되고, 지방 분해/인슐린 자극 포도당 흡수가 증가하고, 가장 악명 높게, 열 발생 호흡에 관여하는 미토콘?…

Discussion

갈색 / 베이지 색 지방 조직 공학 분야는 대체로 미성숙 22,23,24,25,26,27,28이며, 대부분의 지방 모델은 백색 지방 조직 8,22,31을 위해 개발되고 있습니다 ….

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Acosta 박사는 국립 보건원 보조금 CA148724 및 TL1TR002647의 지원을 받습니다. 곤잘레스 포라스 박사는 국립 보건원 (National Institutes of Health)의 당뇨병 및 소화기 및 신장 질환 연구소 (National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases)의 지원을 받고 있습니다. 이 연구는 국립 보건원 (National Institutes of Health, 5SC1DK122578)과 텍사스 대학교 샌 안토니오 생물 의학 공학과 (University of Texas at San Antonio Department of Biomedical Engineering)의 지원을 받았습니다. 내용은 전적으로 저자의 책임이며 반드시 국립 보건원의 공식 견해를 나타내는 것은 아닙니다. 그림은 부분적으로 Biorender.com 로 만들어졌습니다.

Materials

Aminocaproic Acid Sigma Aldrich A2504-100G Added in DMEM at the concentration of 1 mg/mL
Blunt-Tipped Scissors Fisher scientific 12-000-172 Sterilize in autoclave
Bovin Serum Albumin (BSA) Millipore 126575-10GM Diluted in PBS to 4 mg/mL and 1 mg/mL
Collagenase Type 1 Fisher scientific NC9633623 Diluted to 6 mg/mL in BSA 4 mg/mL, Digestion of minced fat
Dexamethasone Thermo Scientific AC230302500 Diluted in ethanol at a 2 mg/ml stock concentration
Disposable underpads Fisher scientific 23-666-062 For fluid absorption during surgery
Dissecting Scissors Fisher scientific 08-951-5 Sterilize in autoclave
Dulbecco′s Modified Eagle′s Medium (DMEM) Fisher scientific 11885092
Dulbecco′s Modified Eagle′s Medium/Nutrient Mixture F-12 Ham (DMEM/F12) Sigma Aldrich D8062
Fetal Bovine Serum  Fisher scientific 16140089 Added in DMEM to 20% v/v.
Fibrinogen  Sigma Aldrich F8630-25G Solubilized in DMEM at the concentration of 20 mg/mL, Protein found in blood plasma and main component of hydrogel
Flask, 250 mL Fisher scientific FB500250 Allows for digestion of fat using a large surface area
Forceps Fisher scientific 50-264-21 Sterilize in autoclave, For handling of tissue and filters
Forskolin Sigma Aldrich F6886 Diluted in ethanol at a 10 mM stock concentration
Human MVF Advanced Solutions Life Scienes, LLC https://www.advancedsolutions.com/microvessels Human MVFs (hMVFs) isolated from three different patients (52-, 54-, and 56-year old females) were used in the current study. 
Indomethacine  Sigma Aldrich I7378 Diluted in ethanol at a 12.5 mM stock concentration
Insulin from porcine pancreas Sigma Aldrich I5523 Diluted in 0.01 N HCl at a 5 mg/ml stock concentration
MycoZap Fisher scientific NC9023832 Added in DMEM to 0.2% w/v, Mycoplasma Prophylactic 
Pennycilin/Streptomycin (10,000 U/mL) Fisher scientific 15140122 Added in DMEM to 1% v/v.
Petri dishes, polystyrene (100 mm x 15 mm). Fisher scientific 351029 3 for removal of blood vessels and mincing, 8 (lid) for presoaking of screens & 8 (dish) for use when filtering with 500 or 37 µM screens
Petri dishes, polystyrene (35 mm x 10 mm). Fisher scientific 50-202-036 For counting fragments
Phosphate Buffer Saline (PBS) Fisher scientific 14-190-250 Diluted to 1x with sterile deionized water.
Rat Clippers (Andwin Mini Arco Pet Trimmer) Fisher scientific NC0854141
Rosiglitazone Fisher scientific R0106200MG Diluted in DMSO at a 10 mM stock concentration
Scissors Fine Science Tools 14059-11 1 for initial incision, 1 for epididymal incision, 1 for tip clipping
Screen  37 µM  Carolina Biological Supply Company 652222R Cut into 3" rounded squares and sterilized in ethylene oxide, Fragment entrapment and removal of very small fragments/single cells and debris
Screen 500 µM  Carolina Biological Supply Company 652222F Cut into 3" rounded squares and sterilized in ethylene oxide, Removes larger fragments/debris
Serrated Hemostat Fisher scientific 12-000-171 Sterilize in autoclave, For clamping of skin before incision
Steriflip Filter 0.22 μm  Millipore SE1M179M6
Thrombin Fisher scientific 6051601KU Diluted in deionzed water to 10 U/mL, Used as a clotting agent turning fibrinogen to fibrin
Thyroid hormone (T3) Sigma Aldrich T2877 Diluted in 1N NaOH at a 0.02 mM stock concentration
Zucker diabetic fatty (ZDF) rats – obese (FA/FA) or lean (FA/+) male  Charles River https://www.criver.com/products-services/find-model/zdf-rat-lean-fa?region=3611
https://www.criver.com/products-services/find-model/zdf-rat-obese?region=3611		 Obtained from Charles River (Wilmington, MA). Rats were acquired at 4 weeks of age and fed Purina 5008 until euthanasia (15-19 weeks of age). Glucose levels (blood from the lateral saphenous vein) were greater than 300 mg/dL in all FA/FA rats used in the study. All animals were housed in a temperature-controlled environment with a 12-h light-dark cycle and fed ad libitum.
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Acosta, F. M., Gonzalez Porras, M. A., Stojkova, K., Pacelli, S., Rathbone, C. R., Brey, E. M. Three-Dimensional Culture of Vascularized Thermogenic Adipose Tissue from Microvascular Fragments. J. Vis. Exp. (192), e64650, doi:10.3791/64650 (2023).
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