Трехмерная культура васкуляризированной термогенной жировой ткани из микрососудистых фрагментов

Summary

Здесь мы представляем подробный протокол, описывающий использование микрососудистых фрагментов, выделенных из жировой ткани грызунов или человека, в качестве простого подхода к созданию функциональной, васкуляризированной бежевой жировой ткани.

Abstract

Инженерная термогенная жировая ткань (например, бежевые или коричневые жировые ткани) была исследована в качестве потенциальной терапии метаболических заболеваний или для разработки персонализированных микротканей для скрининга здоровья и тестирования лекарств. Современные стратегии часто довольно сложны и не могут точно полностью отразить многоклеточные и функциональные свойства термогенной жировой ткани. Микрососудистые фрагменты, небольшие интактные микрососуды, состоящие из артериол, венул и капилляров, выделенных из жировой ткани, служат единым аутологичным источником клеток, которые обеспечивают васкуляризацию и образование жировой ткани. В данной статье описываются методы оптимизации условий культивирования для получения трехмерных, васкуляризированных и функциональных термогенных жировых тканей из микрососудистых фрагментов, включая протоколы выделения микрососудистых фрагментов из жировой ткани и условий культивирования. Кроме того, обсуждаются лучшие практики, а также методы характеристики сконструированных тканей, а также приводятся результаты образцов микрососудистых фрагментов как грызунов, так и человека. Этот подход может быть использован для понимания и разработки методов лечения ожирения и метаболических заболеваний.

Introduction

Целью этого протокола является описание подхода к развитию васкуляризированной бежевой жировой ткани из одного, потенциально аутологичного источника, микрососудистого фрагмента (MVF). Было продемонстрировано, что коричневые и бежевые жировые ткани проявляют полезные свойства, связанные с метаболической регуляцией; Однако небольшой объем этих депо жировой ткани у взрослых ограничивает потенциальное влияние на системный метаболизм, особенно при таких болезненных состояниях, как ожирение или диабет 2 типа 1,2,3,4,5,6,7. Существует значительный интерес к коричнево-бежевому жиру как терапевтической мишени для предотвращения вредных метаболических эффектов, связанных с ожирением и сопутствующими заболеваниями 8,9,10,11,12.

MVF представляют собой сосудистые структуры, которые могут быть непосредственно изолированы от жировой ткани, культивированы и поддерживаться в трехмерной конфигурации в течение длительных периодов времени^13,14,15. Предыдущая работа нашей группы и других ученых начала использовать многоклеточную и мультипотентную способность MVF, особенно в том, что касается образования жировой ткани^16,17,18. В качестве наращивания этой работы мы недавно продемонстрировали, что MVF, полученные из моделей грызунов здорового диабета и диабета 2 типа¹⁹ и от людей (взрослых старше 50 лет)²⁰, содержат клетки, способные индуцироваться для образования термогенной или бежевой жировой ткани.

Здесь представлен инновационный подход, в котором используется MVF из одного источника, способный не только создавать бежевую жировую ткань, но и связанный с ней и критический сосудистый компонент²¹. Использование этого метода может иметь большое значение для исследований, ищущих простой тканеинженерный подход к образованию термогенной жировой ткани. В отличие от других методов, направленных на создание бежевой жировой ткани 22,23,24,25,26,27,28, процесс, описанный в этом исследовании^, не требует использования нескольких типов клеток или сложных схем индукции. Васкуляризированные модели бежевого и белого жира могут быть созданы с помощью MVF, происходящих от грызунов и людей, демонстрируя большой потенциал перевода. Конечным продуктом этого протокола является сконструированная бежевая термогенная жировая ткань со структурой и метаболической функцией, сравнимыми с бурой жировой тканью. В целом, этот протокол представляет идею о том, что легкодоступный и, возможно, аутологичный источник MVF может быть полезным терапевтическим вмешательством и инструментом для изучения метаболических нарушений.

Protocol

Это исследование было проведено в соответствии с Законом о благополучии животных и Положениями о благополучии животных в соответствии с принципами Руководства по уходу за лабораторными животными и их использованию. Все процедуры для животных были одобрены Институциональным комитет?…

Representative Results

Существует несколько ключевых фенотипических морфологических характеристик бежевой/бурой жировой ткани: она многолопастная/содержит мелкие липидные капли, обладает большим количеством митохондрий (причина ее характерного «коричневатого» вида in vivo), соответственно имеет высок?…

Discussion

Область коричнево-бежевой жировой тканевой инженерии в значительной степени незрелая 22,23,24,25,26,27,28, при этом основная часть жировых моделей разрабатывается для белой жировой ткани ^{8,22,31</su…}

Materials

Aminocaproic Acid	Sigma Aldrich	A2504-100G	Added in DMEM at the concentration of 1 mg/mL
Blunt-Tipped Scissors	Fisher scientific	12-000-172	Sterilize in autoclave
Bovin Serum Albumin (BSA)	Millipore	126575-10GM	Diluted in PBS to 4 mg/mL and 1 mg/mL
Collagenase Type 1	Fisher scientific	NC9633623	Diluted to 6 mg/mL in BSA 4 mg/mL, Digestion of minced fat
Dexamethasone	Thermo Scientific	AC230302500	Diluted in ethanol at a 2 mg/ml stock concentration
Disposable underpads	Fisher scientific	23-666-062	For fluid absorption during surgery
Dissecting Scissors	Fisher scientific	08-951-5	Sterilize in autoclave
Dulbecco′s Modified Eagle′s Medium (DMEM)	Fisher scientific	11885092
Dulbecco′s Modified Eagle′s Medium/Nutrient Mixture F-12 Ham (DMEM/F12)	Sigma Aldrich	D8062
Fetal Bovine Serum	Fisher scientific	16140089	Added in DMEM to 20% v/v.
Fibrinogen	Sigma Aldrich	F8630-25G	Solubilized in DMEM at the concentration of 20 mg/mL, Protein found in blood plasma and main component of hydrogel
Flask, 250 mL	Fisher scientific	FB500250	Allows for digestion of fat using a large surface area
Forceps	Fisher scientific	50-264-21	Sterilize in autoclave, For handling of tissue and filters
Forskolin	Sigma Aldrich	F6886	Diluted in ethanol at a 10 mM stock concentration
Human MVF	Advanced Solutions Life Scienes, LLC	https://www.advancedsolutions.com/microvessels	Human MVFs (hMVFs) isolated from three different patients (52-, 54-, and 56-year old females) were used in the current study.
Indomethacine	Sigma Aldrich	I7378	Diluted in ethanol at a 12.5 mM stock concentration
Insulin from porcine pancreas	Sigma Aldrich	I5523	Diluted in 0.01 N HCl at a 5 mg/ml stock concentration
MycoZap	Fisher scientific	NC9023832	Added in DMEM to 0.2% w/v, Mycoplasma Prophylactic
Pennycilin/Streptomycin (10,000 U/mL)	Fisher scientific	15140122	Added in DMEM to 1% v/v.
Petri dishes, polystyrene (100 mm x 15 mm).	Fisher scientific	351029	3 for removal of blood vessels and mincing, 8 (lid) for presoaking of screens & 8 (dish) for use when filtering with 500 or 37 µM screens
Petri dishes, polystyrene (35 mm x 10 mm).	Fisher scientific	50-202-036	For counting fragments
Phosphate Buffer Saline (PBS)	Fisher scientific	14-190-250	Diluted to 1x with sterile deionized water.
Rat Clippers (Andwin Mini Arco Pet Trimmer)	Fisher scientific	NC0854141
Rosiglitazone	Fisher scientific	R0106200MG	Diluted in DMSO at a 10 mM stock concentration
Scissors	Fine Science Tools	14059-11	1 for initial incision, 1 for epididymal incision, 1 for tip clipping
Screen  37 µM	Carolina Biological Supply Company	652222R	Cut into 3" rounded squares and sterilized in ethylene oxide, Fragment entrapment and removal of very small fragments/single cells and debris
Screen 500 µM	Carolina Biological Supply Company	652222F	Cut into 3" rounded squares and sterilized in ethylene oxide, Removes larger fragments/debris
Serrated Hemostat	Fisher scientific	12-000-171	Sterilize in autoclave, For clamping of skin before incision
Steriflip Filter 0.22 μm	Millipore	SE1M179M6
Thrombin	Fisher scientific	6051601KU	Diluted in deionzed water to 10 U/mL, Used as a clotting agent turning fibrinogen to fibrin
Thyroid hormone (T3)	Sigma Aldrich	T2877	Diluted in 1N NaOH at a 0.02 mM stock concentration
Zucker diabetic fatty (ZDF) rats – obese (FA/FA) or lean (FA/+) male	Charles River	https://www.criver.com/products-services/find-model/zdf-rat-lean-fa?region=3611 https://www.criver.com/products-services/find-model/zdf-rat-obese?region=3611	Obtained from Charles River (Wilmington, MA). Rats were acquired at 4 weeks of age and fed Purina 5008 until euthanasia (15-19 weeks of age). Glucose levels (blood from the lateral saphenous vein) were greater than 300 mg/dL in all FA/FA rats used in the study. All animals were housed in a temperature-controlled environment with a 12-h light-dark cycle and fed ad libitum.