JoVE Journal > Bioengineering
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Bioengineering

Mikrovasküler Fragmanlardan Vaskülarize Termojenik Yağ Dokusunun Üç Boyutlu Kültürü

Published: February 03, 2023
doi:
10.3791/64650
, , , , ,
1Department of Biochemistry and Structural Biology,University of Texas Health Science Center, 2Department of Biomedical Engineering and Chemical Engineering,University of Texas at San Antonio, 3Institute of Regenerative Medicine,University of Texas at San Antonio

Summary

Burada, kemirgen veya insan yağ dokusundan izole edilen mikrovasküler fragmanların işlevsel, vaskülarize bej yağ dokusunun mühendisliğine basit bir yaklaşım olarak kullanımını özetleyen ayrıntılı bir protokol sunuyoruz.

Abstract

Mühendislik termojenik yağ dokusu (örneğin, bej veya kahverengi yağ dokuları), metabolik hastalıklar için potansiyel bir tedavi olarak veya sağlık taraması ve ilaç testi için kişiselleştirilmiş mikrodokuların tasarımı için araştırılmıştır. Mevcut stratejiler genellikle oldukça karmaşıktır ve termojenik yağ dokusunun çok hücreli ve fonksiyonel özelliklerini tam olarak tam olarak tasvir edememektedir. Yağ dokusundan izole edilen arteriol, venüller ve kılcal damarlardan oluşan küçük bozulmamış mikrodamarlar olan mikrovasküler fragmanlar, vaskülarizasyon ve yağ dokusu oluşumunu sağlayan tek bir otolog hücre kaynağı olarak işlev görür. Bu makalede, mikrovasküler fragmanların yağ dokusu ve kültür koşullarından izole edilmesine yönelik protokoller de dahil olmak üzere, mikrovasküler fragmanlardan üç boyutlu, vaskülarize ve fonksiyonel termojenik yağ dokularının üretilmesini sağlamak için kültür koşullarını optimize etme yöntemleri açıklanmaktadır. Ek olarak, mühendislik dokularını karakterize etme teknikleri gibi en iyi uygulamalar tartışılmakta ve hem kemirgen hem de insan mikrovasküler fragmanlarından numune sonuçları sağlanmaktadır. Bu yaklaşım, obezite ve metabolik hastalıklara yönelik tedavilerin anlaşılması ve geliştirilmesi için kullanılma potansiyeline sahiptir.

Introduction

Bu protokolün amacı, potansiyel olarak otolog tek bir kaynaktan, mikrovasküler fragmandan (MVF) vaskülarize bej yağ dokusu geliştirmek için bir yaklaşımı tanımlamaktır. Kahverengi ve bej yağ dokularının metabolik regülasyon ile ilgili faydalı özellikler gösterdiği gösterilmiştir; Bununla birlikte, yetişkinlerde bu yağ dokusu depolarının küçük hacmi, özellikle obezite veya tip 2 diyabet 1,2,3,4,5,6,7 gibi hastalıklı durumlarda, sistemik metabolizma üzerindeki potansiyel etkiyi sınırlar. Obezite ve komorbiditeleri ile bağlantılı zararlı metabolik etkilerin önlenmesinde terapötik bir hedef olarak kahverengi / bej yağa önemli bir ilgi vardır 8,9,10,11,12.

MVF’ler, yağ dokusundan doğrudan izole edilebilen, kültürlenebilen ve uzun süre üç boyutlu bir konfigürasyonda tutulabilen damar yapılarıdır13,14,15. Grubumuzun ve diğerlerinin önceki çalışmaları, MVF’lerin çok hücreli ve çok güçlü kapasitesini, özellikle yağ dokusu oluşumu16,17,18 ile ilgili olarak kullanmaya başlamıştır. Bu çalışmanın bir birikimi olarak, yakın zamanda sağlıklı ve tip 2 diyabet19’un kemirgen modellerinden ve insan deneklerden (50 yaşın üzerindeki yetişkinler)20 türetilen MVF’lerin, termojenik veya bej yağ dokusu oluşturmak için indüklenebilen hücreler içerdiğini gösterdik.

Burada, sadece bej yağ dokusu oluşturmakla kalmayıp aynı zamanda ilişkili ve kritik vasküler bileşenini de oluşturabilen tek bir kaynak MVF’nin kullanıldığı yenilikçi bir yaklaşımbulunmaktadır 21. Bu tekniğin kullanımı, termojenik yağ dokusu oluşumu için basit bir doku mühendisliği yaklaşımı arayan çalışmalar için büyük değer taşıyabilir. Bej yağ dokusu 22,23,24,25,26,27,28’in mühendisliğini amaçlayan diğer yöntemlerin aksine, bu çalışmada açıklanan süreç çoklu hücre tiplerinin veya karmaşık indüksiyon rejimlerinin kullanılmasını gerektirmez. Kemirgen ve insan kaynaklarından kaynaklanan MVF’ler ile vaskülarize bej ve beyaz yağ modelleri oluşturulabilir ve bu da büyük çeviri potansiyeli gösterir. Bu protokolün son ürünü, kahverengi yağ dokusu ile karşılaştırılabilir bir yapıya ve metabolik fonksiyona sahip, tasarlanmış bir bej termojenik yağ dokusudur. Genel olarak, bu protokol, kolayca erişilebilen ve muhtemelen otolog bir kaynak MVF’nin metabolik bozuklukları incelemek için değerli bir terapötik müdahale ve araç olabileceği fikrini sunmaktadır.

Protocol

Bu çalışma, Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu ilkelerine uygun olarak Hayvan Refahı Yasası ve Hayvan Refahı Yönetmeliğinin Uygulanmasına uygun olarak gerçekleştirilmiştir. Tüm hayvan prosedürleri, San Antonio’daki Teksas Üniversitesi’ndeki Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından onaylanmıştır. NOT: Aşağıda açıklanan adımlar için erkek Lewis Sıçanları kullanılmıştır. Bir dişi için hafif protokol ayarlamaları yap…

Representative Results

Bej / kahverengi yağ dokusunun birkaç önemli fenotipik morfolojik özelliği vardır: multilokülerdir / küçük lipit damlacıkları içerir, çok sayıda mitokondriye sahiptir (karakteristik olarak “kahverengimsi” görünümünün nedeni in vivo), buna bağlı olarak yüksek oksijen tüketim oranına / mitokondriyal biyoenerjetik özelliklere sahiptir, yüksek vaskülarize olmuş, lipoliz / insülin ile uyarılmış glikoz alımını arttırmıştır ve en ünlüsü, termojenik solunumda rol oynayan mitok…

Discussion

Kahverengi/bej yağ dokusu mühendisliği alanı büyük ölçüde olgunlaşmamış 22,23,24,25,26,27,28 olup, beyaz yağ dokusu için yağ modellerinin büyük kısmıgeliştirilmektedir 8,22,31. M…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dr. Acosta, Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından CA148724 ve TL1TR002647 hibeleri ile desteklenmektedir. Dr. Gonzalez Porras, Ulusal Sağlık Enstitüleri Ulusal Diyabet ve Sindirim ve Böbrek Hastalıkları Enstitüsü tarafından F32-0DK122754 Ödül Numarası altında desteklenmektedir. Bu çalışma, kısmen, Ulusal Sağlık Enstitüleri (5SC1DK122578) ve San Antonio’daki Teksas Üniversitesi Biyomedikal Mühendisliği Bölümü tarafından desteklenmiştir. İçerik yalnızca yazarların sorumluluğundadır ve Ulusal Sağlık Enstitüleri’nin resmi görüşlerini temsil etmek zorunda değildir. Rakamlar kısmen Biorender.com ile oluşturulmuştur.

Materials

Aminocaproic Acid Sigma Aldrich A2504-100G Added in DMEM at the concentration of 1 mg/mL
Blunt-Tipped Scissors Fisher scientific 12-000-172 Sterilize in autoclave
Bovin Serum Albumin (BSA) Millipore 126575-10GM Diluted in PBS to 4 mg/mL and 1 mg/mL
Collagenase Type 1 Fisher scientific NC9633623 Diluted to 6 mg/mL in BSA 4 mg/mL, Digestion of minced fat
Dexamethasone Thermo Scientific AC230302500 Diluted in ethanol at a 2 mg/ml stock concentration
Disposable underpads Fisher scientific 23-666-062 For fluid absorption during surgery
Dissecting Scissors Fisher scientific 08-951-5 Sterilize in autoclave
Dulbecco′s Modified Eagle′s Medium (DMEM) Fisher scientific 11885092
Dulbecco′s Modified Eagle′s Medium/Nutrient Mixture F-12 Ham (DMEM/F12) Sigma Aldrich D8062
Fetal Bovine Serum  Fisher scientific 16140089 Added in DMEM to 20% v/v.
Fibrinogen  Sigma Aldrich F8630-25G Solubilized in DMEM at the concentration of 20 mg/mL, Protein found in blood plasma and main component of hydrogel
Flask, 250 mL Fisher scientific FB500250 Allows for digestion of fat using a large surface area
Forceps Fisher scientific 50-264-21 Sterilize in autoclave, For handling of tissue and filters
Forskolin Sigma Aldrich F6886 Diluted in ethanol at a 10 mM stock concentration
Human MVF Advanced Solutions Life Scienes, LLC https://www.advancedsolutions.com/microvessels Human MVFs (hMVFs) isolated from three different patients (52-, 54-, and 56-year old females) were used in the current study. 
Indomethacine  Sigma Aldrich I7378 Diluted in ethanol at a 12.5 mM stock concentration
Insulin from porcine pancreas Sigma Aldrich I5523 Diluted in 0.01 N HCl at a 5 mg/ml stock concentration
MycoZap Fisher scientific NC9023832 Added in DMEM to 0.2% w/v, Mycoplasma Prophylactic 
Pennycilin/Streptomycin (10,000 U/mL) Fisher scientific 15140122 Added in DMEM to 1% v/v.
Petri dishes, polystyrene (100 mm x 15 mm). Fisher scientific 351029 3 for removal of blood vessels and mincing, 8 (lid) for presoaking of screens & 8 (dish) for use when filtering with 500 or 37 µM screens
Petri dishes, polystyrene (35 mm x 10 mm). Fisher scientific 50-202-036 For counting fragments
Phosphate Buffer Saline (PBS) Fisher scientific 14-190-250 Diluted to 1x with sterile deionized water.
Rat Clippers (Andwin Mini Arco Pet Trimmer) Fisher scientific NC0854141
Rosiglitazone Fisher scientific R0106200MG Diluted in DMSO at a 10 mM stock concentration
Scissors Fine Science Tools 14059-11 1 for initial incision, 1 for epididymal incision, 1 for tip clipping
Screen  37 µM  Carolina Biological Supply Company 652222R Cut into 3" rounded squares and sterilized in ethylene oxide, Fragment entrapment and removal of very small fragments/single cells and debris
Screen 500 µM  Carolina Biological Supply Company 652222F Cut into 3" rounded squares and sterilized in ethylene oxide, Removes larger fragments/debris
Serrated Hemostat Fisher scientific 12-000-171 Sterilize in autoclave, For clamping of skin before incision
Steriflip Filter 0.22 μm  Millipore SE1M179M6
Thrombin Fisher scientific 6051601KU Diluted in deionzed water to 10 U/mL, Used as a clotting agent turning fibrinogen to fibrin
Thyroid hormone (T3) Sigma Aldrich T2877 Diluted in 1N NaOH at a 0.02 mM stock concentration
Zucker diabetic fatty (ZDF) rats – obese (FA/FA) or lean (FA/+) male  Charles River https://www.criver.com/products-services/find-model/zdf-rat-lean-fa?region=3611
https://www.criver.com/products-services/find-model/zdf-rat-obese?region=3611		 Obtained from Charles River (Wilmington, MA). Rats were acquired at 4 weeks of age and fed Purina 5008 until euthanasia (15-19 weeks of age). Glucose levels (blood from the lateral saphenous vein) were greater than 300 mg/dL in all FA/FA rats used in the study. All animals were housed in a temperature-controlled environment with a 12-h light-dark cycle and fed ad libitum.
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cohen, P., Spiegelman, B. M. Brown and beige fat: molecular parts of a thermogenic machine. Diabetes. 64 (7), 2346-2351 (2015).
  2. Liu, X., et al. Brown adipose tissue transplantation reverses obesity in Ob/Ob mice. Endocrinology. 156 (7), 2461-2469 (2015).
  3. Tharp, K. M., Stahl, A. Bioengineering beige adipose tissue therapeutics. Frontiers in Endocrinology. 6, 164 (2015).
  4. Barquissau, V., et al. White-to-brite conversion in human adipocytes promotes metabolic reprogramming towards fatty acid anabolic and catabolic pathways. Molecular Metabolism. 5 (5), 352-365 (2016).
  5. Kim, S. H., Plutzky, J. Brown fat and browning for the treatment of obesity and related metabolic disorders. Diabetes & Metabolism Journal. 40 (1), 12-21 (2016).
  6. Lizcano, F., Vargas, D. Biology of beige adipocyte and possible therapy for type 2 diabetes and obesity. International Journal of Endocrinology. 2016, 9542061 (2016).
  7. Mulya, A., Kirwan, J. P. Brown and beige adipose tissue: therapy for obesity and its comorbidities. Endocrinology and Metabolism Clinics of North America. 45 (3), 605-621 (2016).
  8. Murphy, C. S., Liaw, L., Reagan, M. R. In vitro tissue-engineered adipose constructs for modeling disease. BMC Biomedical Engineering. 1, 27 (2019).
  9. Srivastava, S., Veech, R. L. Brown and brite: The fat soldiers in the anti-obesity fight. Frontiers in Physiology. 10, 38 (2019).
  10. Samuelson, I., Vidal-Puig, A. Studying brown adipose tissue in a human in vitro context. Frontiers in Endocrinology. 11, 629 (2020).
  11. Wang, C. -. H., et al. CRISPR-engineered human brown-like adipocytes prevent diet-induced obesity and ameliorate metabolic syndrome in mice. Science Translational Medicine. 12 (558), (2020).
  12. Kaisanlahti, A., Glumoff, T. Browning of white fat: agents and implications for beige adipose tissue to type 2 diabetes. Journal of Physiology and Biochemistry. 75 (1), 1-10 (2019).
  13. Sato, N., et al. Development of capillary networks from rat microvascular fragments in vitro: the role of myofibroblastic cells. Microvascular Research. 33 (2), 194-210 (1987).
  14. Laschke, M. W., Später, T., Menger, M. D. Microvascular fragments: More than just natural vascularization units. Trends in Biotechnology. 39 (1), 24-33 (2021).
  15. Hoying, J. B., Boswell, C. A., Williams, S. K. Angiogenic potential of microvessel fragments established in three-dimensional collagen gels. In Vitro Cellular & Developmental Biology-Animal. 32 (7), 409-419 (1996).
  16. Acosta, F. M., Stojkova, K., Brey, E. M., Rathbone, C. R. A straightforward approach to engineer vascularized adipose tissue using microvascular fragments. Tissue Engineering. Part A. 26 (15-16), 905-914 (2020).
  17. Acosta, F. M., et al. Adipogenic differentiation alters properties of vascularized tissue-engineered skeletal muscle. Tissue Engineering. Part A. 28 (1-2), 54-68 (2021).
  18. Strobel, H. A., Gerton, T., Hoying, J. B. Vascularized adipocyte organoid model using isolated human microvessel fragments. Biofabrication. 13 (3), 035022 (2021).
  19. Acosta, F. M., et al. Engineering functional vascularized beige adipose tissue from microvascular fragments of models of healthy and type II diabetes conditions. Journal of Tissue Engineering. 13, 20417314221109337 (2022).
  20. Gonzalez Porras, M. A., Stojkova, K., Acosta, F. M., Rathbone, C. R., Brey, E. M. Engineering human beige adipose tissue. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 10, 906395 (2022).
  21. Herold, J., Kalucka, J. Angiogenesis in adipose tissue: The interplay between adipose and endothelial cells. Frontiers in Physiology. 11, 1861 (2021).
  22. McCarthy, M., et al. Fat-On-A-Chip models for research and discovery in obesity and its metabolic comorbidities. Tissue Engineering Part B: Reviews. 26 (6), 586-595 (2020).
  23. Klingelhutz, A. J., et al. Scaffold-free generation of uniform adipose spheroids for metabolism research and drug discovery. Scientific Reports. 8 (1), 523 (2018).
  24. Yang, J. P., et al. Metabolically active three-dimensional brown adipose tissue engineered from white adipose-derived stem cells. Tissue Engineering. Part A. 23 (7-8), 253-262 (2017).
  25. Vaicik, M. K., et al. Hydrogel-based engineering of beige adipose tissue. Journal of Materials Chemistry B. 3 (40), 7903-7911 (2015).
  26. Tharp, K. M., Stahl, A. Bioengineering beige adipose tissue therapeutics. Frontiers in Endocrinology. 6, 164 (2015).
  27. Tharp, K. M., et al. Matrix-assisted transplantation of functional beige adipose tissue. Diabetes. 64 (11), 3713-3724 (2015).
  28. Harms, M. J., et al. Mature human white adipocytes cultured under membranes maintain identity, function, and can transdifferentiate into brown-like adipocytes. Cell Reports. 27 (1), 213-225 (2019).
  29. Frueh, F. S., Später, T., Scheuer, C., Menger, M. D., Laschke, M. W. Isolation of murine adipose tissue-derived microvascular fragments as vascularization units for tissue engineering. Journal of Visualized Experiments. (122), e55721 (2017).
  30. Cannon, B., Nedergaard, J. Brown adipose tissue: Function and physiological significance. Physiological Reviews. 84 (1), 277-359 (2004).
  31. Unser, A. M., Tian, Y., Xie, Y. Opportunities and challenges in three-dimensional brown adipogenesis of stem cells. Biotechnology Advances. 33, 962-979 (2015).
  32. Dani, V., Yao, X., Dani, C. Transplantation of fat tissues and iPSC-derived energy expenditure adipocytes to counteract obesity-driven metabolic disorders: Current strategies and future perspectives. Reviews in Endocrine & Metabolic Disorders. 23 (1), 103-110 (2022).
  33. Xu, X., et al. Adipose tissue-derived microvascular fragments as vascularization units for dental pulp regeneration. Journal of Endodontics. 47 (7), 1092-1100 (2021).
  34. McDaniel, J. S., Pilia, M., Ward, C. L., Pollot, B. E., Rathbone, C. R. Characterization and multilineage potential of cells derived from isolated microvascular fragments. Journal of Surgical Research. 192 (1), 214-222 (2014).
  35. Gealekman, O., et al. Depot-specific differences and insufficient subcutaneous adipose tissue angiogenesis in human obesity. Circulation. 123 (2), 186-194 (2011).
  36. Altalhi, W., Hatkar, R., Hoying, J. B., Aghazadeh, Y., Nunes, S. S. Type I diabetes delays perfusion and engraftment of 3D constructs by impinging on angiogenesis; which can be rescued by hepatocyte growth factor supplementation. Cellular and Molecular Bioengineering. 12 (5), 443-454 (2019).
  37. Altalhi, W., Sun, X., Sivak, J. M., Husain, M., Nunes, S. S. Diabetes impairs arterio-venous specification in engineered vascular tissues in a perivascular cell recruitment-dependent manner. Biomaterials. 119, 23-32 (2017).
  38. Laschke, M. W., et al. Adipose tissue-derived microvascular fragments from aged donors exhibit an impaired vascularisation capacity. European Cells & Materials. 28, 287-298 (2014).
  39. Später, T., et al. Vascularization of microvascular fragment isolates from visceral and subcutaneous adipose tissue of mice. Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 19 (1), 161-175 (2021).
  40. Später, T., et al. Adipose tissue-derived microvascular fragments from male and female fat donors exhibit a comparable vascularization capacity. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 9, 777687 (2021).
  41. Laschke, M. W., Menger, M. D. The simpler, the better: tissue vascularization using the body’s own resources. Trends in Biotechnology. 40 (3), 281-290 (2022).
  42. Yang, F., Cohen, R. N., Brey, E. M. Optimization of co-culture conditions for a human vascularized adipose tissue model. Bioengineering. 7 (3), 114 (2020).
  43. Pilkington, A. -. C., Paz, H. A., Wankhade, U. D. Beige adipose tissue identification and marker specificity-Overview. Frontiers in Endocrinology. 12, 599134 (2021).
  44. Chiou, G., et al. Scaffold architecture and matrix strain modulate mesenchymal cell and microvascular growth and development in a time dependent manner. Cellular and Molecular Bioengineering. 13 (5), 507-526 (2020).

Tags

3D CultureMicrovascular FragmentsMVFsBeige FatObesityMetabolic DiseaseInguinal FatEpididymal FatPosterior Subcutaneous FatAdipogenesisVascularization
check_url/64650?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Acosta, F. M., Gonzalez Porras, M. A., Stojkova, K., Pacelli, S., Rathbone, C. R., Brey, E. M. Three-Dimensional Culture of Vascularized Thermogenic Adipose Tissue from Microvascular Fragments. J. Vis. Exp. (192), e64650, doi:10.3791/64650 (2023).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image