עלון חדשני המודפס בתלת-ממד ונועד לאפשר תרביות תאים דו-ממדיות ותלת-ממדיות פשוטות
Summary
במאמר זה, עלון מודפס תלת-ממדי שעוצב לאחרונה מוצג כמודל של תרבית משותפת ומאומת באמצעות המחקר של התקשורת הבין-תאית הפרקרינית בין תאי אנדותל וקרטינוציטים.
Abstract
הניתוחים הקלאסיים של תקשורת עקיפה בין סוגי תאים שונים מחייבים שימוש במדיה מותנית. יתר על כן, הייצור של מדיה מותנית נשאר זמן רב רחוק תנאים פיזיולוגיים פתולוגיים. למרות שכמה מודלים של תרבית משותפת זמינים מסחרית, הם נשארים מוגבלים לבדיקות ספציפיות והם מיועדים בעיקר לשני סוגים של תאים.
כאן, תוספות מודפסות 3D משמשים כי הם תואמים בדיקות פונקציונליות רבות. התוספת מאפשרת הפרדה של באר אחת של צלחת 6 בארות לארבעה תאים. ניתן להגדיר מגוון רחב של שילובים. יתר על כן, חלונות מתוכננים בכל קיר של התאים כך שתקשורת בין-תאית פוטנציאלית בין כל תא אפשרית במדיום התרבות באופן תלוי נפח. לדוגמה, תקשורת בין-תאית פרקרינית יכולה להיחקר בין ארבעה סוגי תאים בחד-שכבתיים, בתלת-ממד (ספרואידים), או על ידי שילוב של שניהם. בנוסף, ניתן לזרוע תערובת של סוגי תאים שונים באותו תא בפורמט דו-ממדי או תלת-ממדי (אורגנואידים). היעדר תחתית בתוספות המודפסות בתלת-ממד מאפשר את תנאי התרבית הרגילים על הלוח, ציפוי אפשרי על הלוח המכיל את העלון, והדמיה ישירה במיקרוסקופ אופטי. התאים המרובים מאפשרים לאסוף סוגי תאים שונים באופן עצמאי או להשתמש, בכל תא, בריאגנטים שונים למיצוי RNA או חלבונים. במחקר זה, ניתנת מתודולוגיה מפורטת לשימוש בעלון החדש המודפס בתלת-ממד כמערכת תרבות משותפת. כדי להדגים מספר יכולות של מודל גמיש ופשוט זה, בדיקות פונקציונליות שפורסמו בעבר של תקשורת תאית בוצעו בתוספות החדשות שהודפסו בתלת-ממד והודגמו כניתנות לשחזור. התוספות שהודפסו בתלת-ממד ותרבית התאים הקונבנציונלית באמצעות מדיה מותנית הובילו לתוצאות דומות. לסיכום, העלון המודפס בתלת-ממד הוא מכשיר פשוט שניתן להתאים לדגמים רבים של תרביות משותפות עם סוגי תאים דבקים.
Introduction
In vivo, תאים מתקשרים זה עם זה באופן ישיר (מגע עם התא) או בעקיפין (על ידי הפרשת מולקולות). כדי לחקור תקשורת תאים, ניתן לפתח מודלים שונים של תרביות משותפות, כגון תרבית משותפת ישירה (סוגי התאים השונים נמצאים באינטראקציה ישירה באותה באר) ותרבית משותפת ממודרת (סוגי התאים השונים נמצאים באינטראקציה עקיפה בתאים שונים של מערכת תרבית)1. יתר על כן, מדיה מותנית יכולה לשמש למערכות תרבית משותפת, שבהן האינטראקציה העקיפה מתאפשרת על ידי מולקולות מופרשות הכלולות במדיה המותנית של סוג תא משפיע המועברות לתא מגיבמסוג 1.
במקרה של מחקרי תקשורת תאים פרקרינית, מערכות תרבית משותפת עקיפות מספקות מודלים המשקפים באופן חזק אינטראקציות תאים in vivo. מערכות תרבות משותפת עקיפה פותחו ומוסחרו, ומאפשרות הקמת מודלים עקיפים של תרבות משותפת 2,3. למרבה הצער, רוב מערכות התרבות המשותפת העקיפות מספקות רק שני תאים. מערכות תרבות משותפת עקיפות אחרות מספקות תאים מרובים, אך הם פחות ניתנים להרחבה בהשוואה למערכת המדווחת בכתב היד הנוכחי. חלקם אינם מאפשרים הדמיה קלאסית תחת מיקרוסקופ, והם מציגים לעתים קרובות שיטות יישום ספציפיות. במספר מחקרים, התקשורת הפרקרינית בין סוגי תאים שונים נבדקת על ידי מודל המדיה המותנית 4,5,6,7. זוהי דרך חקירה קלה יותר בהשוואה למערכות עקיפות של תרבות משותפת מכיוון שהיא אינה מחייבת שיטות או חומרים ספציפיים כדי לבסס1. מצד שני, הכנת מדיה מותנית גוזלת זמן ומספקת מידע רק על איתות סלולרי חד-כיווני (משפיע למגיב)1.
במאמר זה מוצעת דרך חדשה ופשוטה לחקור תקשורת תאית. מאפשר שילוב של מספר סוגי תאים באינטראקציה ישירה או עקיפה ובפורמטים דו-ממדיים או תלת-ממדיים, התוספות המודפסות מציגות יתרונות רבים להגדרת מודלים של תרבות משותפת בקלות. התוספת המודפסת בתלת-ממד, המותאמת להצבה בבארות של לוחות 6 בארות, היא מעגלית ומאפשרת הפרדה של הבאר לארבעה תאים (שני תאים גדולים ושני תאים קטנים; איור 1A). התוספות המודפסות בתלת-ממד מאופיינות בהיעדר תחתית. לפיכך, התאים נמצאים במגע ישיר עם הצלחת שעליה ממוקם העלון. בנוסף, ניתן לצפות כל תא בנפרד מהאחרים. יתר על כן, ניתן לעקוב בקלות אחר התנהגות התא תחת מיקרוסקופים אופטיים. נוכחותם של חלונות תקשורת בכל קיר של הכנס מאפשרת תוספת, בזמן אופטימלי, של מדיום משותף לביצוע ניסויים שונים של תרבות משותפת. שילובים רבים של תרביות משותפות יכולים להתבצע כדי לחקור תקשורת ישירה ו / או עקיפה בין מספר סוגי תאים. לדוגמה, ניתן לתכנן מודל של תרבית משותפת עקיפה בין ארבעה סוגי תאים שונים בחד-שכבה ו/או בתלת-ממד (ספרואידים). שילוב של מודלים ישירים ועקיפים של תרביות משותפות יכול להתבצע גם על ידי ערבוב סוגי תאים שונים באותו תא. ההשפעה של מבנים מורכבים (אורגנואידים, צמחי רקמות וכו ‘) על סוגי תאים שונים יכולה להיות דוגמה נוספת למודלים שניתן ליצור. יתר על כן, התוספות המודפסות בתלת-ממד תואמות לבדיקות פונקציונליות של ביולוגיה של התא (התפשטות, הגירה, היווצרות פסאודו-צינורות, התמיינות וכו ‘) ולבדיקות ביוכימיות (מיצוי DNA, RNA, חלבון, שומנים וכו ‘). לבסוף, התוספות המודפסות בתלת-ממד מספקות מגוון רחב של סכמות ניסיוניות של מודלים של תרבות משותפת עם אפשרות לשלב בו זמנית בדיקות שונות באותו ניסוי בתאים השונים.
חלק מהיכולות של התוספות המודפסות בתלת-ממד מוצגות כדי לאמת אותן כמודל מהיר וקל לשימוש של תרבות משותפת. בהשוואה למחקר שפורסם בעבר שנערך על תקשורת תאים פרקרינית, הודגמה היכולת של התוספות המודפסות בתלת-ממד להיות מודל תרבית משותפת בעל ערך. כדי להעריך נקודה זו, הושוותה ויסות התרבות תאי אנדותל ונדידתם על ידי קרטינוציטים בין מערכת ההחדרה המודפסת בתלת-ממד לבין המערכת הקלאסית באמצעות מדיה מותנית. התוספות המודפסות בתלת-ממד מאפשרות קבלת תוצאות דומות במהירות בהשוואה למערכת הקונבנציונלית המשתמשת במדיה מותנית. ואכן, התוספות המודפסות בתלת-ממד מספקות מודל חזק לחקר אינטראקציות תאים בשני הכיוונים ללא צורך לייצר מדיה מותנית ועם אפשרות לבצע במקביל את מבחני ההתרבות והנדידה באותו ניסוי.
לסיכום, במאמר זה, מוצע מודל חדש ומוכן לשימוש לחקר תקשורת תאית. תואמות לכל סוגי התאים הדבקים, התוספות המודפסות בתלת-ממד מאפשרות לבצע שילובים רבים של תרביות משותפות שמטרתן להיות קרובות יותר לתנאי in vivo .
Protocol
Representative Results
Discussion
תקשורת סלולרית עקיפה נחקרת בדרך כלל באמצעות מדיה מותנית או התקני מערכת תרבות משותפת. הכנת מדיה מותנית גוזלת זמן רב במעלה הזרם בניסויים, ושיטה זו מוגבלת לניתוחי אפקטים חד-צדדיים. המחקר הקודם של Colin-Pierre et al.8 באמצעות מדיה מותנית נערך על תקשורת תאית עקיפה בין שני סוגי תאים (HDMEC…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
מחקר זה נעשה בשיתוף פעולה עם BASF Beauty Care Solutions. גב’ צ’רלי קולין-פייר היא עמיתת דוקטורט במימון BASF / CNRS.
ברצוננו להודות למר מהדי סלאמי על הרעיון של התוספות המודפסות בתלת-ממד.
Materials
| Autoclave | Getinge | APHP | Solid cycle, 121 °C for 20 min |
| Biomed Clear | Formlabs | RS-F2-BMCL-01 | Impression performed by 3D-Morphoz company (Reims, France) |
| Cell culture detergents | Tounett | A18590/0116 | |
| Cell Proliferation Reagent WST-1 | Roche | 11,64,48,07,001 | |
| Counting slide | NanoEnTek | EVE-050 | |
| Culture-Insert 2 Well in μ-Dish 35 mm | Ibidi | 80206 | two-migration chambers device. |
| Endothelial cell medium | ScienCell | 1001 | Basal medium +/- 25 mL of fetal bovine serum (FBS, 0025), 5 mL of endothelial cell growth supplement (ECGS, 1052), and 5 mL of penicillin/streptomycin solution (P/S, 0503). |
| EVE Automated cell counter | NanoEnTek | NESCT-EVE-001E | |
| EVOS XL Core | Fisher Scientific | AMEX1200 | 10x of magnification |
| Food silicon reagent and catalyst kit | Artificina | RTV 3428 A and B | (10:1) |
| FORM 3B printer | Formlabs | PKG-F3B-WSVC-DSP-BASIC | Impression performed by 3D-Morphoz company |
| Human Dermal Microvascular Endothelial Cells (HDMEC) | ScienCell | 2000 | |
| Keratinocytes of Outer Root Sheath (KORS ) | ScienCell | 2420 | |
| Macro Wound Healing Tool Software | ImageJ | Software used for the measurement of the uncovered surface (for migration assays) | |
| Mesenchymal stem cell medium | ScienCell | 7501 | Basal medium +/-25 mL of fetal bovine serum (FBS, 0025), 5 mL of mesenchymal stem cell growth supplement (MSCGS, 7552), and 5 mL of penicillin/streptomycin solution (P/S, 0503) |
| Microplate reader SPECTRO star NANO | BMG Labtech | BMG LABTECH software | |
| PBS | Promocell | C-40232 | Without Ca2+ / Mg2+ |
| Trypan Blue Stain | NanoEnTek | EBT-001 | |
| Trypsin / EDTA | Promocell | C-41020 | Incubation of KORS at 37 °C with 5% CO2 for 5 min. Incubation of HDMECs for 5 min at room temperature |
| 96-well plate Nunclon Delta Surface | Thermoscientific | 167008 |
References
- Regier, M. C., Alarid, E. T., Beebe, D. J. Progress towards understanding heterotypic interactions in multi-culture models of breast cancer. Integrative Biology. 8 (6), 684-692 (2016).
- Doğan, A., Demirci, S., Apdik, H., Apdik, E. A., Şahin, F. Mesenchymal stem cell isolation from pulp tissue and co-culture with cancer cells to study their interactions. Journal of Visualized Experiments. (143), e58825 (2019).
- Lin, J., et al. Long non-coding RNA UBE2CP3 enhances HCC cell secretion of VEGFA and promotes angiogenesis by activating ERK1/2/HIF-1α/VEGFA signalling in hepatocellular carcinoma. Journal of Experimental & Clinical Cancer Research. 37 (1), 113 (2018).
- Soares, N. L., et al. Carbon monoxide modulation of microglia-neuron communication: Anti-neuroinflammatory and neurotrophic role. Molecular Neurobiology. 59 (2), 872-889 (2022).
- Al Halawani, A., Abdulkhalek, L., Mithieux, S. M., Weiss, A. S. Tropoelastin promotes the formation of dense, interconnected endothelial networks. Biomolecules. 11 (9), 1318 (2021).
- Mercatali, L., et al. Development of a human preclinical model of osteoclastogenesis from peripheral blood monocytes co-cultured with breast cancer cell lines. Journal of Visualized Experiments. (127), e56311 (2017).
- Orona, N. S., Astort, F., Maglione, G. A., Yakisich, J. S., Tasat, D. R. Direct and indirect effect of air particles exposure induce Nrf2-dependent cardiomyocyte cellular response in vitro. Cardiovascular Toxicology. 19 (6), 575-587 (2019).
- Colin-Pierre, C., et al. The glypican-1/HGF/C-met and glypican-1/VEGF/VEGFR2 ternary complexes regulate hair follicle angiogenesis. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 781172 (2021).
- Toubal, A., et al. The NC1 domain of type XIX collagen inhibits melanoma cell migration. European Journal of Dermatology. 20 (6), 712-718 (2010).
- Wu, A. -. L., et al. Role of growth factors and internal limiting membrane constituents in müller cell migration. Experimental Eye Research. 202, 108352 (2021).
- Oudart, J. -. B., et al. Plasmin releases the anti-tumor peptide from the NC1 domain of collagen XIX. Oncotarget. 6 (6), 3656-3668 (2015).
- Martinotti, S., Ranzato, E. Scratch wound healing assay. Methods in Molecular Biology. 2109, 225-229 (2020).
- Cattin, S., Ramont, L., Rüegg, C. Characterization and in vivo validation of a three-dimensional multi-cellular culture model to study heterotypic interactions in colorectal cancer cell growth, invasion and metastasis. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 6, 97 (2018).
- Ma, Y. N., et al. Three-dimensional spheroid culture of adipose stromal vascular cells for studying adipogenesis in beef cattle. Animal. 12 (10), 2123-2129 (2018).
