Summary

Basit 2D ve 3D hücre kültürlerini mümkün kılmak için tasarlanmış yenilikçi bir 3D baskılı ek parça

Published: January 06, 2023
doi:

Summary

Bu yazıda, yeni tasarlanmış bir 3D baskılı ek, bir ko-kültür modeli olarak sunulmuş ve endotel hücreleri ile keratinositler arasındaki parakrin hücreler arası iletişimin incelenmesiyle doğrulanmıştır.

Abstract

Farklı hücre tipleri arasındaki dolaylı iletişimin klasik analizleri, şartlandırılmış ortamların kullanılmasını gerektirir. Ayrıca, şartlandırılmış ortamın üretimi zaman alıcı ve fizyolojik ve patolojik koşullardan uzak kalmaktadır. Birkaç ko-kültür modeli ticari olarak mevcut olmasına rağmen, bunlar spesifik tahlillerle sınırlı kalır ve çoğunlukla iki tip hücre içindir.

Burada, çok sayıda fonksiyonel tahlil ile uyumlu 3D baskılı kesici uçlar kullanılmaktadır. Ek parça, 6 oyuklu bir plakanın bir oyuğunun dört bölmeye ayrılmasına izin verir. Çok çeşitli kombinasyonlar ayarlanabilir. Ayrıca, bölmelerin her duvarında pencereler tasarlanmıştır, böylece her bölme arasında potansiyel hücreler arası iletişim, kültür ortamında hacme bağlı bir şekilde mümkün olur. Örneğin, parakrin hücreler arası iletişim, tek katmanlı, 3 boyutlu (sferoidler) veya her ikisini birleştirerek dört hücre tipi arasında incelenebilir. Ek olarak, farklı hücre tiplerinin bir karışımı aynı bölmede 2D veya 3D (organoidler) formatında ekilebilir. 3D baskılı eklerde bir tabanın olmaması, plaka üzerinde olağan kültür koşullarına, eki içeren plaka üzerinde olası kaplamaya ve optik mikroskopi ile doğrudan görselleştirmeye izin verir. Çoklu bölmeler, farklı hücre tiplerini bağımsız olarak toplama veya her bölmede RNA veya protein ekstraksiyonu için farklı reaktifler kullanma imkanı sağlar. Bu çalışmada, yeni 3D baskılı eki bir ko-kültür sistemi olarak kullanmak için ayrıntılı bir metodoloji sağlanmıştır. Bu esnek ve basit modelin çeşitli kapasitelerini göstermek için, daha önce yayınlanmış hücre iletişiminin fonksiyonel tahlilleri yeni 3D baskılı eklerde gerçekleştirildi ve tekrarlanabilir olduğu gösterildi. 3D baskılı ekler ve şartlandırılmış ortam kullanan geleneksel hücre kültürü benzer sonuçlara yol açtı. Sonuç olarak, 3D baskılı ek, yapışık hücre tiplerine sahip çok sayıda ko-kültür modeline uyarlanabilen basit bir cihazdır.

Introduction

İn vivo olarak, hücreler birbirleriyle doğrudan (hücre teması) veya dolaylı olarak (moleküllerin salgılanmasıyla) iletişim kurar. Hücre iletişimini incelemek için, doğrudan ko-kültür (farklı hücre tipleri aynı kuyuda doğrudan etkileşim halindedir) ve bölümlere ayrılmış ko-kültür (farklı hücre tipleri bir kültür sisteminin farklı bölmelerinde dolaylı etkileşim içindedir) gibi farklı ko-kültür modelleri geliştirilebilir1. Ayrıca, koşullu ortam, dolaylı etkileşimin, bir efektör hücre tipinin koşullu ortamında bulunan salgılanan moleküllerin bir yanıt veren hücre tip1’e aktarılmasıyla sağlandığı ko-kültür sistemleri için kullanılabilir.

Parakrin hücre iletişim çalışmaları söz konusu olduğunda, dolaylı ko-kültür sistemleri, hücre etkileşimlerini in vivo olarak güçlü bir şekilde yansıtan modeller sağlar. Dolaylı eş-kültür sistemleri geliştirilmiş ve ticarileştirilmiştir, bu da dolaylı eş-kültür modellerinin kurulmasına olanak sağlamıştır 2,3. Ne yazık ki, çoğu dolaylı ko-kültür sistemi sadece iki bölme sağlar. Diğer dolaylı ko-kültür sistemleri çoklu bölmeler sağlar, ancak bu makalede bildirilen sisteme kıyasla daha az ölçeklenebilirler. Bazıları mikroskop altında klasik bir görselleştirmeye izin vermez ve genellikle belirli uygulama yöntemleri sunarlar. Çeşitli çalışmalarda, farklı hücre tipleri arasındaki parakrin iletişim, koşullu ortam modeli 4,5,6,7 ile incelenmiştir. Bu, dolaylı ko-kültür sistemlerine kıyasla daha kolay bir araştırma yöntemidir, çünkü belirli yöntemlerin veya materyallerin oluşturulmasını gerektirmez1. Öte yandan, şartlandırılmış ortamın hazırlanması zaman alıcıdır ve yalnızca tek yönlü hücre sinyalizasyonu (efektörden yanıtlayıcıya) hakkında bilgi sağlar1.

Bu yazıda, hücre iletişimini araştırmak için yeni ve basit bir yol önerilmiştir. Doğrudan veya dolaylı etkileşimde ve 2D veya 3D formatlarında çeşitli hücre tiplerinin kombinasyonuna izin veren basılı ekler, ko-kültür modellerinin kolayca kurulması için çok sayıda avantaj sunar. 6 oyuklu plakaların kuyucuklarına yerleştirilmek üzere uyarlanmış olan 3D baskılı ek parça daireseldir ve kuyunun dört bölmeye ayrılmasına izin verir (iki büyük bölme ve iki küçük bölme; Şekil 1A). 3D baskılı ekler, bir tabanın olmaması ile karakterize edilir. Böylece hücreler, ekin yerleştirildiği plaka ile doğrudan temas halindedir. Ek olarak, her bölme diğerlerinden bağımsız olarak kaplanabilir. Ayrıca, hücre davranışı optik mikroskoplar altında kolayca takip edilebilir. Ek parçanın her duvarında iletişim pencerelerinin varlığı, farklı ortak kültür deneyleri yapmak için ortak bir ortamın en uygun zamanda eklenmesine izin verir. Çeşitli hücre tipleri arasındaki doğrudan ve/veya dolaylı iletişimi incelemek için çok sayıda ko-kültür kombinasyonu gerçekleştirilebilir. Örneğin, tek tabakalı ve/veya 3 boyutlu (sferoidler) dört farklı hücre tipi arasında dolaylı bir ko-kültür modeli tasarlanabilir. Doğrudan ve dolaylı ko-kültür modellerinin bir kombinasyonu, aynı bölmede farklı hücre tiplerinin karıştırılmasıyla da gerçekleştirilebilir. Karmaşık yapıların (organoidler, doku eksplantı vb.) farklı hücre tipleri üzerindeki etkisi, yapılabilecek modellere başka bir örnek olabilir. Ayrıca, 3D baskılı ekler, hücre biyolojisi fonksiyonel tahlilleri (proliferasyon, migrasyon, psödotüp oluşumu, farklılaşma vb.) ve biyokimya testleri (DNA, RNA, protein, lipitlerin ekstraksiyonu, vb.) ile uyumludur. Son olarak, 3D baskılı ekler, aynı deneyde aynı anda farklı tahlilleri farklı bölmelerde birleştirme imkanı ile çok çeşitli ko-kültür modellerinin deneysel şemalarını sağlar.

3D baskılı eklerin bazı kapasiteleri, bunları hızlı ve kullanımı kolay bir ortak kültür modeli olarak doğrulamak için sunulmuştur. Parakrin hücre iletişimi üzerine daha önce yayınlanmış bir çalışma ile karşılaştırıldığında, 3D baskılı eklerin değerli bir ko-kültür modeli olma yeteneği gösterilmiştir. Bu noktayı değerlendirmek için, keratinositler tarafından endotel hücre proliferasyonunun ve migrasyonunun düzenlenmesi, 3D baskılı insert sistemi ile şartlandırılmış ortam kullanan klasik sistem arasında karşılaştırıldı. 3D baskılı kesici uçlar, şartlandırılmış medya kullanan geleneksel sisteme kıyasla benzer sonuçların hızlı bir şekilde elde edilmesini sağlar. Gerçekten de, 3D baskılı ekler, şartlandırılmış ortam üretme zorunluluğu olmadan ve aynı deneyde proliferasyon ve migrasyon testlerini paralel olarak gerçekleştirme olasılığı ile her iki yönde hücre etkileşimlerini incelemek için sağlam bir model sağlar.

Sonuç olarak, bu yazıda hücre iletişimini incelemek için yeni ve kullanıma hazır bir model önerilmiştir. Tüm yapışık hücre tipleriyle uyumlu olan 3D baskılı ekler, in vivo koşullara daha yakın olmayı amaçlayan çok sayıda ko-kültür kombinasyonunun gerçekleştirilmesine olanak tanır.

Protocol

NOT: 3D ekler (Şekil 1A) ticari olarak temin edilir ve hücre kültürü ve otoklavlama ile biyouyumlu bir fotopolimer reçine kullanılarak basılır (Malzeme Tablosuna bakın). Bu bölümde, eklerle ko-kültür modelini oluşturmak için ayrıntılı bir protokol açıklanmaktadır (bkz. Şekil 1B). Bazı uygulama örnekleri de verilmiştir. 1. Sterilize edilmiş ek parçanın 6 oyuklu plakalara yerleştirilm…

Representative Results

Bu çalışmada, şartlandırılmış ortamların kullanımı yoluyla klasik yöntemlerle karşılaştırılabilir sağlam, güvenilir ve anlamlı veriler elde etmek için optimize edilmiş bir ko-kültür sistemi tanımlanmıştır. 3D baskılı ekler, deneylerde zorlukların ve zaman alıcı koşullu ortam üretiminin üstesinden gelerek, etkileşim halindeki farklı hücre tiplerinin in vivo mikroçevre koşullarını taklit eder. Saç foliküllerinde bulunan iki hücre tipi arasındaki dolaylı etkileşimler…

Discussion

Dolaylı hücre iletişimi genellikle koşullu ortam veya ko-kültür sistemi cihazları kullanılarak araştırılır. Şartlandırılmış ortam hazırlama, deneylerde yukarı yönde zaman alıcıdır ve bu yöntem tek taraflı etki analizleriyle sınırlıdır. Colin-Pierre ve arkadaşları tarafından yapılan önceki çalışma.8 şartlandırılmış ortam kullanılarak, iki hücre tipi (HDMEC’ler ve KORS) arasındaki dolaylı hücre iletişimi üzerinde gerçekleştirilmiştir. Bu ?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Bu çalışma BASF Beauty Care Solutions ile işbirliği içinde yapılmıştır. Charlie Colin-Pierre, BASF /CNRS tarafından finanse edilen bir doktora bursiyeridir.

Sayın Mehdi Sellami’ye 3D baskılı eklerin konsepti için teşekkür etmek istiyoruz.

Materials

Autoclave Getinge APHP Solid cycle, 121 °C for 20 min
Biomed Clear Formlabs RS-F2-BMCL-01 Impression performed by 3D-Morphoz company (Reims, France)
Cell culture detergents  Tounett A18590/0116
Cell Proliferation Reagent WST-1 Roche 11,64,48,07,001
Counting slide NanoEnTek EVE-050
Culture-Insert 2 Well in μ-Dish 35 mm Ibidi 80206 two-migration chambers device. 
Endothelial cell medium ScienCell 1001 Basal medium +/- 25 mL of fetal bovine serum (FBS, 0025), 5 mL of endothelial cell growth supplement (ECGS, 1052), and 5 mL of penicillin/streptomycin solution (P/S, 0503).
EVE Automated cell counter  NanoEnTek NESCT-EVE-001E 
EVOS XL Core Fisher Scientific AMEX1200 10x of magnification
Food silicon reagent and catalyst kit Artificina RTV 3428 A and B  (10:1)
FORM 3B printer Formlabs PKG-F3B-WSVC-DSP-BASIC Impression performed by 3D-Morphoz company
Human Dermal Microvascular Endothelial Cells (HDMEC) ScienCell 2000
Keratinocytes of Outer Root Sheath (KORS ) ScienCell 2420
Macro Wound Healing Tool Software ImageJ Software used for the measurement of the uncovered surface (for migration assays)
Mesenchymal stem cell medium  ScienCell 7501 Basal medium +/-25 mL of fetal bovine serum (FBS, 0025), 5 mL of mesenchymal stem cell growth supplement (MSCGS, 7552), and 5 mL of penicillin/streptomycin solution (P/S, 0503)
Microplate reader SPECTRO star NANO BMG Labtech BMG LABTECH software
PBS Promocell C-40232 Without Ca2+ / Mg2+
Trypan Blue Stain NanoEnTek EBT-001
Trypsin / EDTA Promocell C-41020 Incubation of KORS at 37 °C with 5% CO2 for 5 min. Incubation of HDMECs for 5 min at room temperature
96-well plate Nunclon Delta Surface Thermoscientific 167008

References

  1. Regier, M. C., Alarid, E. T., Beebe, D. J. Progress towards understanding heterotypic interactions in multi-culture models of breast cancer. Integrative Biology. 8 (6), 684-692 (2016).
  2. Doğan, A., Demirci, S., Apdik, H., Apdik, E. A., Şahin, F. Mesenchymal stem cell isolation from pulp tissue and co-culture with cancer cells to study their interactions. Journal of Visualized Experiments. (143), e58825 (2019).
  3. Lin, J., et al. Long non-coding RNA UBE2CP3 enhances HCC cell secretion of VEGFA and promotes angiogenesis by activating ERK1/2/HIF-1α/VEGFA signalling in hepatocellular carcinoma. Journal of Experimental & Clinical Cancer Research. 37 (1), 113 (2018).
  4. Soares, N. L., et al. Carbon monoxide modulation of microglia-neuron communication: Anti-neuroinflammatory and neurotrophic role. Molecular Neurobiology. 59 (2), 872-889 (2022).
  5. Al Halawani, A., Abdulkhalek, L., Mithieux, S. M., Weiss, A. S. Tropoelastin promotes the formation of dense, interconnected endothelial networks. Biomolecules. 11 (9), 1318 (2021).
  6. Mercatali, L., et al. Development of a human preclinical model of osteoclastogenesis from peripheral blood monocytes co-cultured with breast cancer cell lines. Journal of Visualized Experiments. (127), e56311 (2017).
  7. Orona, N. S., Astort, F., Maglione, G. A., Yakisich, J. S., Tasat, D. R. Direct and indirect effect of air particles exposure induce Nrf2-dependent cardiomyocyte cellular response in vitro. Cardiovascular Toxicology. 19 (6), 575-587 (2019).
  8. Colin-Pierre, C., et al. The glypican-1/HGF/C-met and glypican-1/VEGF/VEGFR2 ternary complexes regulate hair follicle angiogenesis. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 781172 (2021).
  9. Toubal, A., et al. The NC1 domain of type XIX collagen inhibits melanoma cell migration. European Journal of Dermatology. 20 (6), 712-718 (2010).
  10. Wu, A. -. L., et al. Role of growth factors and internal limiting membrane constituents in müller cell migration. Experimental Eye Research. 202, 108352 (2021).
  11. Oudart, J. -. B., et al. Plasmin releases the anti-tumor peptide from the NC1 domain of collagen XIX. Oncotarget. 6 (6), 3656-3668 (2015).
  12. Martinotti, S., Ranzato, E. Scratch wound healing assay. Methods in Molecular Biology. 2109, 225-229 (2020).
  13. Cattin, S., Ramont, L., Rüegg, C. Characterization and in vivo validation of a three-dimensional multi-cellular culture model to study heterotypic interactions in colorectal cancer cell growth, invasion and metastasis. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 6, 97 (2018).
  14. Ma, Y. N., et al. Three-dimensional spheroid culture of adipose stromal vascular cells for studying adipogenesis in beef cattle. Animal. 12 (10), 2123-2129 (2018).
check_url/64655?article_type=t

Play Video

Cite This Article
Colin-Pierre, C., El Baraka, O., Ramont, L., Brézillon, S. An Innovative 3D-Printed Insert Designed to Enable Straightforward 2D and 3D Cell Cultures. J. Vis. Exp. (191), e64655, doi:10.3791/64655 (2023).

View Video